新疆小海子垦区媒介蜱及其携带梨形虫种类鉴定

张 峰，王正荣，蒋建军，薄新文，张艳艳*，贾春英

(1.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子 832000； 2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000 ；3.新疆生产建设兵团第三师畜牧兽医工作站，新疆图木舒克 843900)

梨形虫病(Piroplasmosis)是一类经硬蜱传播、由巴贝斯属(Babesia)和泰勒属(Theileria)原虫所引起的血液原虫病的总称[1]，主要引起宿主贫血消瘦、黄疸高热、血红蛋白尿等临床症状，严重时可导致宿主死亡[2]。梨形虫种类繁多，全球记载的各种哺乳动物巴贝斯虫有67种[3]，泰勒虫有13种[4]，其中对牛危害最大的是双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、牛巴贝斯虫(B.bovis)、环形泰勒虫和小泰勒虫(T.parva)[5]。硬蜱在梨形虫的传播中起到了关键作用，在已发现的9属硬蜱中有4属被证明可作为牛梨形虫病的传播媒介。在巴贝斯虫方面，牛巴贝斯虫的媒介蜱有篦子硬蜱(Ixodesricinus)、微小牛蜱(Boophilusmicroplus)、囊形扇头蜱(R.bursa)等。微小牛蜱被证实是双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫的传播媒介，镰形扇头蜱(R.haemaphysaloides)不仅可以传播牛巴贝斯虫，还可以传播东方巴贝斯虫(T.orientalis))，长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)可传播卵形巴贝斯虫(B.ovata)。在泰勒虫，已确定有4种媒介蜱是环形泰勒虫的传播者，即残缘璃眼蜱(H.detritum)、小亚璃眼蜱、嗜驼璃眼蜱(H.dromedarii)、盾糙璃眼蜱(H.scuperse)。东方泰勒虫是由长角血蜱、青海血蜱(H.qinghaiensis)、日本血蜱(H.japonica)传播。青海血蜱和长角血蜱也可传播瑟氏泰勒虫(T.sergenti)。本研究旨在调查小海子垦区媒介蜱及其携带梨形虫的种类，查明该区域梨形虫种群分布。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2020年5月～7月，在新疆小海子垦区及周边7个采样点(红旗农场、伽师总场、44团、46团、49团、50团、51团)共采集524只硬蜱，均为璃眼蜱属和扇头蜱属。

1.1.2 主要试剂与仪器 DAN提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000，Takara公司产品；普通显微镜，北京瑞科中仪科技有限公司产品；Nikon三目显微镜，上海普赫光电科技有限公司产品；DS-Filc数字摄像系统，上海普赫光电科技有限公司产品；96梯度PCR仪和凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品处理及形态学鉴定 将采集的硬蜱放入沸水中停留5 s，使其肢体展开，用PBS缓冲液反复冲洗体表异物，放入含有甘油的750 mL/L酒精中，置-20℃保存。参照文献[6-7]对硬蜱在光学显微镜下进行形态学鉴定。

1.2.2 硬蜱基因组DNA的提取 在提取硬蜱DNA前，用500、300、100 mL/L酒精分别浸泡1 h，再用蒸馏水浸泡1 h，尽可能将硬蜱剪碎。按照DNA试剂盒说明书提取DNA。

1.2.3 梨形虫18S rRNA基因扩增 引物参照文献[8-9]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系20 μL：Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。巴贝斯虫反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 5 min。泰勒虫反应条件：94℃ 5 min；94℃ 45 s，58℃ 1 min，72℃ 90 s，共30个循环；72℃ 10 min。最后取10 μL PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测(表1)。

表1 引物序列及目的片段长短

1.2.4 序列测定与分析 将PCR阳性扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，通过Blast进行基因的同源序列比对。用Clustal W软件进行多序列比对，最后用MEGA7软件，用邻接法构建系统发育树，其自展值检验为1 000。

2 结果

2.1 硬蜱形态学鉴定

在新疆小海子垦区及周边地区7个采样点采集到524只硬蜱，在光学显微镜下初步鉴定为璃眼蜱属和扇头蜱属，共5种，包括小亚璃眼蜱293只(55.92%)、亚洲璃眼蜱100只(19.08%)、图兰扇头蜱79只(15.08%)、麻点璃眼蜱47只(8.97%)，血红扇头蜱5只(0.95%)(图1～图5)。

图1 小亚璃眼蜱鉴定结果

图2 亚洲璃眼蜱鉴定结果

2.2 硬蜱体内梨形虫检测结果

用2对梨形虫18S rRNA特异性引物，对小海子垦区及周边地区所采集的524只硬蜱进行PCR检测，共检测出69份阳性样品，总阳性率为13.17%。其中小亚璃眼蜱采集数目最多，牛梨形虫感染率也最高，为23.21%，其次为图兰扇头蜱，为1.27%。而本次所采集的亚洲璃眼蜱、麻点璃眼蜱、血红扇头蜱均未检测出牛梨形虫。因此可确定小亚璃眼蜱和图兰扇头蜱携带梨形虫(表2)。

图3 图兰扇头蜱鉴定结果

图4 麻点璃眼蜱鉴定结果

图5 血红扇头蜱鉴定结果

表2 硬蜱体内牛梨形虫检测结果

2.3 硬蜱体内牛梨形虫种类鉴定

524只硬蜱共检出69份阳性样品,送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，将测序结果在NCBI上进行Blast比对，结果显示,69份阳性样品中有67份为环形泰勒虫，其余2份为绵羊泰勒虫和隐藏巴贝斯虫。环形泰勒虫、隐藏巴贝斯虫为小亚璃眼蜱携带，绵羊泰勒虫为图兰扇头蜱携带。泰勒虫株目的片段约1 530 bp，巴贝斯虫株目的片段约1 300 bp(图6)。

M.DNA标准DL 2 000；1～4.阳性样本；5～6.阳性对照；7.阴性对照

2.4 硬蜱体内牛梨形虫序列分析

将已测序的牛梨形虫18S rRNA目的片段，与GenBank上注册的牛梨形虫18S rRNA序列比较，检测出的两种泰勒虫与GenBank上发表的泰勒虫虫种序列同源性≥97%。以牛巴贝斯虫未定种新疆株(Babesiasp.Xinjiang，XM029015910)作为外类群，用MEGA7软件，以邻接法构建系统发育进化树，发现本文在硬蜱体内检测的环形泰勒虫与环形泰勒虫意大利株(GenBank登录号：MT341858)同源性为100%，与环形泰勒虫喀什株(GenBank登录号：MK415058)同源性为99%；本文所检测到的绵羊泰勒虫与绵羊泰勒虫苏丹株(GenBank登录号：AY260171)同源性97%。对隐藏巴贝斯虫构建系统发育树，以环形泰勒虫喀什株(GenBank登录号：MK415058)作为外类群，结果发现，本文所测定的隐藏巴贝斯虫与隐藏巴贝斯虫土耳其株(GenBank登录号：KP745626)同源性为100%(图7、图8)。

图7 基于环形泰勒虫、绵羊泰勒虫18S rRNA基因构建的系统发育树

图8 基于隐藏巴贝斯虫18S rRNA基因构建的系统发育树

3 讨论

新疆共发现2科9属45种蜱类，蜱类的组成与中亚地区蜱类的组成较为相似，优势蜱属主要有璃眼蜱属、革蜱属、扇头蜱属等，约占全国硬蜱总数的30%以上。本试验对硬蜱盾板形状大小及表面刻点大小分布、假头基形状、须肢长短粗细、缘垛大小形状、足第1基节内外距长度、足肢有无环带、气门板形状等特征观察，在光学显微镜下初步鉴定结果为2属5种，按照数量多少依次为小亚璃眼蜱(293只)、亚洲璃眼蜱(100只)、图兰扇头蜱(79只)、麻点璃眼蜱(47只)、血红扇头蜱(5只)。初步统计小海子垦区及周边硬蜱的优势种主要有小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、图兰扇头蜱。曾记载的银盾革蜱(Dermacentorniveus)、嗜驼璃眼蜱(H.dromedarii)等蜱种未采集到，可能与采集时间、气候改变或植被分布有关。

为确定采集的5种硬蜱为牛梨形虫病的传播媒介，对524只硬蜱进行梨形虫18S rRNA特异性目的片段扩增，结果表明,小亚璃眼蜱和图兰扇头蜱为梨形虫病的媒介蜱。在524份样品中，共检测出69份阳性样品，总阳性率为13.17%，其中环形泰勒虫占67份，其余2份是绵羊泰勒虫和隐藏巴贝斯虫。小亚璃眼蜱感染率最高(23.21%)，且携带环形泰勒虫和隐藏巴贝斯虫2种虫种；图兰扇头蜱感染率为1.27%，并发现了绵羊泰勒虫。环形泰勒虫作为流行最广的泰勒虫种之一，已证实其传播媒介包括小亚璃眼蜱。小亚璃眼蜱在若虫、成虫阶段均能传播环形泰勒虫，而亚洲璃眼蜱各阶段试验结果均为阴性[10]。

隐藏巴贝斯虫在我国少有记载，在中哈边境阿拉山口出首次检测到隐藏巴贝斯虫[11]，且媒介蜱为亚洲璃眼蜱，本病原在非洲由边缘璃眼蜱(H.marginatum)经卵、若虫、成虫传播。本试验在小亚璃眼蜱中检测到该巴贝斯虫种，由此推断隐藏巴贝斯虫的媒介蜱种类较多，表明不仅在边境地区，疆内也出现了该病原，应提高外来牲畜或进出口货物的检疫。绵羊泰勒虫仅在我国新疆地区分布较为广泛，与垦区牛、羊混养的养殖模式有很大关系。绵羊泰勒虫的传播媒介尚不清楚，扇头蜱属、血蜱属、革蜱属中的部分蜱种均能作为其媒介蜱。新疆地区发现的绵羊泰勒虫其媒介蜱为小亚璃眼蜱，本文发现的媒介蜱为图兰扇头蜱，因只有1份阳性样品，其可能性有待进一步研究。