协同增效头孢噻呋钠的MRSA抑制剂的筛选
2022-04-11郝红侠任海燕胡龙飞刘旭东赵红琼郝智慧
郝红侠，任海燕，胡龙飞，刘旭东，赵红琼，郝智慧
(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.中国农业大学动物医学院，中兽医药研究中心，北京 100193； 3.青岛农业大学农用生物制药实验室，山东青岛 266109)
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是引起临床感染性疾病的重要的人兽共患病原菌，由于它多重耐药、传染性强且难以控制，临床感染可引起脓毒症、肺炎或奶牛乳房炎[1]等。动物出现免疫功能减弱、反复感染、发病率和死亡率上升，给畜牧行业带来严重经济损失。目前兽医临床对其感染的疾病治疗可用的抗生素有限,寻找有效的耐药抑制剂协同增效抗生素防控MRSA非常必要。本文从多种黄酮类中药单体和海洋生物材料中筛选出可以增强头孢噻呋钠对MRSA敏感性的活性成分，为兽医临床针对MRSA感染治疗提供辅助药物。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 MRSA菌株ATCC 33591购自上海柯维化学技术有限公司，金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213(Staphylococcusaureus)和临床耐药金葡菌株为本实验室保存菌种。
1.1.2 药品与试剂 78种黄酮类中药单体标准品购自成都瑞芬思生物科技有限公司，规格均为5 mg，具体名称和批号为：原花青素(4852-22-6)，二氢杨梅素(27200-12-0)，巴西苏木素(474-07-7)，血竭素高氯酸盐(125536-25-6)，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(7084-24-4)，西伯利亚远志口山酮 (B20633-67-4)，山奈酚3-O-桑布双糖苷(27661-51-4)，亥茅酚苷(80681-44-3)，丹皮酚(552-41-0)，荭草苷(28608-75-5)，蒿甲醚(71963-77-4)，水仙苷(604-80-8)，毛蕊异黄酮(241125-81-5)，槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷(22688-79-5)，杨梅苷(17912-87-7)，千层纸素A-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷(36948-76-2)，5,7-二羟基色原酮(31721-94-5)，3′-羟基葛根素(117060-54-5)，三叶豆紫檀苷(6807-83-6)，斯皮诺素(72063-39-9)，甜橙黄酮(2306-27-6)，朝藿定A1(140147-77-9)，水飞蓟亭(33889-69-9)，7-O-甲基芒果苷(31002-12-7)，朝藿定C(110642-44-9)，柯因二甲醚(21392-57-4)，百蕊草素I(40437-72-7)，远志山酮Ⅲ(162857-78-5)，5-O-甲基维斯阿米醇苷(84272-85-5)，曲克芦丁(7085-55-4)，异荭草素(4261-42-1)，黄芪总黄酮，野鸢尾苷(491-74-7)，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷(861691-37-4)，葛根素芹菜糖苷(103654-50-8)，异槲皮苷(482-35-9)，3′,4′,5,7-四甲氧基黄酮(855-97-0)，新甘草苷(5088-75-5)，升麻素(80681-45-4)，白麻苷(18609-17-1)，扁蓄苷(572-30-5)，异橙黄酮(17290-70-9)，山奈苷(482-38-2)，芹糖异甘草苷(120926-46-7)，淫羊藿苷(110623-73-9)，黄杞苷(572-31-6)，芒果苷(4773-96-0)，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(29741-09-1)，王不留行黄酮苷(53452-16-7)，柚皮苷二氢查尔酮(18916-17-1)，6′′′-阿魏酰斯皮诺素(77690-92-7)，新橙皮苷(13241-33-3)，新芒果苷(64809-67-2)，漆黄素(528-48-3)，圣草次苷(13463-28-0)，新橙皮苷二氢查尔酮(20702-77-6)，异牡荆素(38953-85-4)，异鼠李素-3-O-新橙皮苷(55033-90-4)，大豆苷(552-66-9)，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(578-74-5)，香蒲新苷(104472-68-6)，落新妇苷(29838-67-3)，淫羊藿次苷(I56725-99-6)，橙皮苷520-26-3)，芦荟苷B(28371-16-6)，银椴苷(20316-62-5)，朝藿定A(110623-72-8)，桑皮苷C(102841-43-0)，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷(60778-02-1)，异甘草苷(120926-46-7)，虎杖苷27208-80-6)，朝藿定B(110623-73-9)，羟基红花黄色素A(146087-19-6)，甘草苷元-7-O-D-芹糖-4′-O-D-葡萄糖苷(74639-14-8)，香蜂草苷(14259-47-3)，黄豆黄苷(40246-10-4)，升麻素苷(17086-76-9)，杯苋甾酮(80681-45-4)。80种海洋生物材料LXQ-N由山东大学提供。头孢噻呋钠(89.4%，HBW180901-15)购自湖北威德利化学科技有限公司。
1.1.3 主要仪器 双人单面垂直超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；自动立式压力蒸汽灭菌器，致微仪器有限公司产品；恒温振荡培养箱和生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；便携式细菌浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制 中药单体用DMSO溶解配制成5 mg/mL的储备母液，4℃冰箱储存；海洋生物材料LXQ-N用DMSO溶解配制成5 mg/mL的储备母液，4℃冰箱储存；头孢噻呋钠配制成5 120 μg/mL作为储备母液，在-20℃冰箱储存。
1.2.2 最小抑菌浓度(MIC)测定 以MRSA菌株ATCC 33591作为试验菌株，用CLSI推荐的微量肉汤稀释法[2]进行各中药单体、海洋生物材料、头孢噻呋钠的MIC的测定。
1.2.3 联合药敏试验 为了检测两种活性成分联合应用后对MRSA的抗菌效果采用微量棋盘稀释法[3]进行，即中药单体、海洋生物材料与头孢噻呋钠联用。以金黄色葡萄球菌ATCC 29213作为质控菌株，MRSA菌株ATCC 33591为试验菌株。
菌悬液的制备：将冻存管里的ATCC 29213、ATCC 33591三区划线接种于BHI琼脂上，36℃培养后，挑取单克隆菌落于MH肉汤中，36℃、180 r/min振荡培养。调整浊度到0.5麦氏浊度(浓度约108CFU/mL)，然后将该菌液稀释100倍，使菌液浓度为106CFU/mL，作为试验菌液。
以MIC结果为参考依据，微量稀释棋盘法采用96孔无菌微孔板，设计两药1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍和1/32倍MIC进行联合。两种药物分别再进行稀释，横列稀释中药单体或海洋生物材料，在96孔板中进行梯度稀释，每孔50 μL。纵列加的是抗生素药物，提前在离心管中进行梯度稀释，每种孔50 μL。试验菌液混匀后用8孔道移液器加入至96孔板的各孔中，每孔100 μL。同时设置中药单体、抗生素的单独MIC、阴性和阳性孔做对照。并置于36℃培养，观察结果并记录。
FICI计算及结果判断[4]：
FIC指数判读标准：当FIC≤0.5时，为协同增效作用；当0.5
1.2.4 最小杀菌浓度(MBC)测定 根据上述结果，对头孢噻呋钠、原花青素的MBC和两者联用时的MBC进行测定。以MRSA菌株ATCC 33591为试验菌株。取最后一个可见菌生长的含药孔和随后每个透明孔的培养物100 μL，均匀涂于MH琼脂平板，36℃培养24 h。
2 结果
2.1 药敏试验结果
以肉眼观察到无细菌生长的最小浓度为该药的MIC，头孢噻呋钠对金葡质控菌ATCC 29213的MIC分别为0.25 μg/mL，符合质控范围(表1)，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、原花青素、二氢杨梅素、巴西苏木素、血竭素高氯酸盐对金葡菌有较好的抑菌作用，对ATCC 33591的MIC分别为400、100、100、25、25 μg/mL，与头孢噻呋钠联合时呈现协同或相加作用。而其他中药单体对ATCC 33591的作用效果均不明显，MIC值>200 μg/mL，FIC值为1.5，与头孢噻呋钠联合作用时均呈现无关作用。
海洋生物材料LXQ-2、LXQ-3、LXQ-4、LXQ-8、LXQ-10、LXQ-15、LXQ-16、LXQ-19、LXQ-32、LXQ-33、LXQ-37、LXQ-38、LXQ-39、LXQ-40、LXQ-46、LXQ-69、LXQ-71、LXQ-76、LXQ-80、LXQ-84、LXQ-85、LXQ-89、LXQ-90、LXQ-93、LXQ-100、LXQ-116、LXQ-123对ATCC 29213的MIC均为200 μg/mL，对ATCC 33591的抗菌效果不明显，而其他海洋生物材料未检测到对金葡菌的抗菌效果。
表1 头孢噻呋钠单用及与中药单体联合对ATCC 33591的MIC和FICI测定结果
2.2 联合药敏试验结果
2.2.1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷与头孢噻呋钠对MRSA的联合药敏试验结果 100μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷能增强头孢噻呋钠对ATCC 33591的抗菌效果；100 μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(即采用1/4 MIC浓度)与头孢噻呋钠联用对ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至0.125 μg/mL，FICI为0.2539。表明100 μg/mL的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷逆转了ATCC 33591对头孢噻呋钠的耐药(CLSI规定对头孢类抗生素的耐药折点为4 μg/mL)。
2.2.2 二氢杨梅素与头孢噻呋钠对MRSA的联合药敏试验结果 12.5μg/mL的二氢杨梅素能增强头孢噻呋钠对ATCC 33591的抗菌效果；12.5 μg/mL的二氢杨梅素(即采用1/8MIC浓度)与头孢噻呋钠联用对ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至8 μg/mL，FICI为0.375。表明12.5 μg/mL的二氢杨梅素可以降低ATCC 33591对头孢噻呋钠的耐药。
2.2.3 原花青素与头孢噻呋钠对MRSA的联合药敏试验结果 25 μg/mL的原花青素能增强头孢噻呋钠对ATCC 33591的抗菌效果；25 μg/mL的原花青素(即采用1/4 MIC浓度的)与头孢噻呋钠联用对ATCC 33591的MIC由32 μg/mL降至4 μg/mL，FIC为0.375。表明25 μg/mL的原花青素逆转了ATCC 33591对头孢噻呋钠的耐药。
2.2.4 原花青素与头孢噻呋钠对MRSA和PRSA临床菌株的联合药敏试验结果 原花青素和头孢噻呋钠对20株山东猪源的临床耐药菌株包括10株MRSA(mecA+，blaZ+)和10株PRSA(blaZ+)的联合抗菌结果见表2和表3。
具有mecA基因的MRSA临床菌株对头孢噻呋钠大部分表现出高度耐药，MIC值≥4 μg/mL。原花青素与头孢噻呋钠联用后，10株MRSA临床菌株菌里有8株菌的联合耐药指数为0.3125～0.5000，说明两者之间具有良好的协同增效作用。对于blaZ基因阳性而mecA基因阴性的PRSA产酶菌株(10株)，原花青素与头孢噻呋钠联用后，PRSA临床菌株的联合耐药指数为0.625～0.750，说明两者之间具有相加作用。原花青素与头孢噻呋钠联合用药后，对MRSA临床菌株呈现协同增效作用，对PRSA临床菌株呈现相加抗菌作用。
2.2.5 最小杀菌浓度(MBC)测定结果 头孢噻呋钠、原青花素对ATCC 33591的MBC分别为64 μg/mL和300 μg/mL。不同浓度的原花青素都能够明显降低头孢噻呋钠的MBC，100 μg/mL原花青素可使头孢噻呋钠对ATCC 33591的MBC由64 μg/mL降至4 μg/mL，下降16倍。而加入50、25、12.5、6.25 μg/mL原花青素时，头孢噻呋钠的MBC分别为8、16、16、32 μg/mL，分别下降8、4、4、2倍，验证了原花青素与头孢噻呋钠联用对ATCC 33591协同增效作用。
3 讨论
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、二氢杨梅素、原花青素、巴西苏木素、血竭素高氯酸盐对ATCC 33591的MIC分别为400、100、100、25、25 μg/mL；原花青素、二氢杨梅素和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷这3种中药单体与头孢噻呋钠联合应用对ATCC 33591均具有明显的协同增效作用，FIC分别为0.375、0.375、0.2539。其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对MRSA的协同增效抗菌效果比原花青素、二氢杨梅素明显。巴西苏木素和血竭素高氯酸盐对ATCC 33591的抗菌效果非常显著，但与头孢噻呋钠联用是相加抗菌作用，单体均呈现无关作用；27种海洋生物材料对ATCC 29213抗菌效果良好，其MIC均为200 μg/mL，而对ATCC 33591的抗菌效果不明显。考虑到原花青素的药理活性多，如抗菌、抗氧化活性、抗癌、抗高血压、抗菌抗病毒等，且无毒，因此选用原花青素与头孢噻呋钠对MRSA和PRSA临床菌株进行联合药敏试验，结果表明两者联用对MRSA临床菌株呈现协同增效作用，对PRSA临床菌株呈现相加作用。最小杀菌浓度(MBC)测定表明12.5 μg/mL原花青素可使头孢噻呋钠对ATCC 33591的MBC值由64 μg/mL降至16 μg/mL。
表2 原花青素(PC)与头孢噻呋钠联合应用对MRSA临床菌株的MIC和FICI的测定结果
表3 原花青素(PC)与头孢噻呋钠联合应用对PRSA临床菌株的MIC和FICI的测定结果
巴西苏木素作为抗菌的有效成分，其抑菌作用与文献[5]报道相符。血竭素高氯酸盐作为血竭的合成化合物，文献[6]已报道了其抗金黄色葡萄球菌。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是花青素家族中的一员，其抗菌活性研究较少。二氢杨梅素对金黄色葡萄球菌抗菌作用较好。这3种中药单体与头孢噻呋钠联用，均能减少头孢噻呋钠的使用量，降低了ATCC 33591对头孢菌素类药物的耐药程度，有潜力成为耐药菌MRSA的抑制剂，协同增效用药已成为近年来削减细菌耐药研究的重要领域。
中药有效成分具有低毒价廉、不易产生细菌耐药、抗菌作用显著等特点[7]，国内外对其协同增效抗生素的研究已有许多，如高良姜素[8]、青蒿琥酯[9]、异土木香内酯[10]、金丝桃素[11]、安石榴苷[12]、紫檀芪[13]均可显著增加β -内酰胺类抗生素对耐药菌的抗菌活性。
MRSA耐药抑制剂的开发和利用会成为治疗兽医临床MRSA感染性疾病的有力武器，本文探究了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、二氢杨梅素、原花青素作为耐药抑制剂的应用潜力，为研发协同增效抗菌、遏制细菌耐药性的抑制剂提供参考。
