柴胡口服液抑制NF-κB-NLRP3通路缓解慢性热应激诱导的肉鸡肺脏炎性损伤

刘逸雷，丁康宁，侯晓礁，秦俊杰，李伟豪，谢智江，刘玉清，何永明，唐陆平*

(佛山科学技术学院动物医学系，广东佛山 528000；2.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102629)

热应激是动物应对周围高温环境产生的一种非特异性反应的总和，当温度过高或持续时间过长时，机体无法进行适应调整，则发生热应激[1]。长期暴露在炎热的环境，体内过多的热量积累会影响机体组织和器官[2]，肺作为机体最重要的散热和气体交换器官，在热应激时动物的快速喘息容易造成肺的损伤，影响肺脏的通气功能，进而影响脑和胃肠道等重要组织器官[3]。随着全球气候变暖和集约化高密度的养殖方式，畜禽更易受到热应激危害，给畜禽养殖业造成巨大经济损失[4]。

柴胡口服液(Radix bupleuri oral liquid，RBO)具有解表退热功能，在临床上缓解由高热引起家禽的不良反应具有一定的效用[5]。方中主要成分柴胡经提取精致成中药合剂[6]，其中含有柴胡皂苷、挥发油、多糖等有效成分[7]，可治疗肺损伤和提高机体免疫功能。本文以肉鸡为试验动物探索柴胡口服液对热应激肉鸡肺损伤的缓解及作用机理，以期为临床实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 柴胡口服液(清开素)由北京生泰尔科技股份有限公司提供(批准文号：兽药字010125347)；解暑抗热散(批号：20190613)，泰安市泰山神药业有限公司产品；白介素6(IL-6)、白介素2(IL-2)、白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒，江苏酶免实业有限公司产品；IL-6、TNF-α、IL-1β、NLPR3、NF-κB抗体，美国Cell Signaling Technology公司产品。

1.1.2 实验动物 1日龄健康肉鸡120只，雌雄各半，购于佛山市南海种鸡场。肉鸡购回后常规饲养至21日龄时开始试验。

1.1.3 主要仪器设备 酶标仪、蛋白电泳仪、蛋白转印仪，美国Bio-Rad公司产品；全自动化学发光图像分析系统，上海天能科技有限公司产品；石蜡切片机，德国MICROM产品；高速低温离心机，德国Eppendorf产品。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理 将21日龄肉鸡随机分为正常对照组、热应激组、热应激+阳性药物组、热应激+柴胡口服液低剂量、热应激+柴胡口服液中剂量组和热应激+柴胡口服液高剂量组，每组20只。正常对照组温度控制在25℃±2℃，热应激各组温度控制为：白天35℃±2℃(10：00～16：00)，其余时间(16：00到翌日10：00)则饲养在25℃±2℃环境中，相对湿度均保持在60%～70%。各组动物分笼，均自由采食和饮水，其中阳性药物组每1 kg饲料添加10 g解暑抗热散；柴胡口服液低剂量组每1 kg饮水添加0.75 mL柴胡口服液；中剂量组每1 kg饮水添加1 mL柴胡口服液；高剂量组每1 kg饮水添加1.25 mL柴胡口服液。分别于热应激第5天和第10天各剖杀一部分鸡用于相关指标检测。

1.2.2 ELISA检测肉鸡血清中炎性因子水平 分别于热应激第5天和第10天从每组随机挑选10只肉鸡，进行静脉采血，分离血清，用ELISA试剂盒检测血清中细胞因子IL-6、IL-2、IL-1β和TNF-α的水平，按试剂盒说明书进行。

1.2.3 HE染色观察肺组织病理变化 将肉鸡于热应激第5天、第10天随机处死后摘取肺组织用中性PBS冲洗，取部分肺脏置于40 mL/L多聚甲醛液中固定48 h。固定完成后取出，用流水冲净固定液(6 h 以上)，取出肺组织依次用500、700、800、950、1000 mL/L酒精对组织进行梯度脱水。脱水后将组织浸泡于二甲苯∶乙醇(1∶1)混合液中 15 min，取出后放入二甲苯中 15 min 进行透明。将透明好的样品置于熔融的石蜡Ⅰ中浸蜡1 h，随后转移至石蜡Ⅱ和石蜡Ⅲ中各浸蜡 1 h，完成浸蜡后取出组织于包埋框中包埋组织，做好标记并切片。HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.2.4 检测热应激肉鸡肺脏器官指数 于热应激第5天、第10天随机挑选10只鸡，处死后摘取肺组织用中性PBS冲洗并用吸水纸擦干后称重，计算肺脏的器官指数，肺指数=肺脏重量(g)/体重(g)。

1.2.5 Western blot法检测肉鸡肺脏组织炎症相关因子的蛋白表达水平 将热应激第5天和第10天取得肺组织部分迅速投入液氮中，于-80℃冰箱保存备用。取100 mg肺组织加入RIPA裂解液并置于冰上裂解30 min，随后于4℃、12 000 r/min离心15 min；取上清进行BCA定量，按1∶4体积加入5×SDS蛋白上样缓冲液和上清液，充分混匀后煮沸变性10 min；取变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，并通过湿转法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜，经50 mL/L脱脂牛奶封闭后洗涤室温下孵育一抗(β-actin、p-p65、p65、NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α)3 h，再次洗涤后孵育相应二抗，用ELC发光液进行显影。

1.2.6 统计分析 用SPSS 24.0软件统计和处理数据，t检验法进行差异比较；用Graph Pad Prism 8.0软件对测得的数据进行统计作图，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 热应激肉鸡血清中炎性因子水平变化

慢性热应激第5天，血清中IL-6和TNF-α含量各组无明显差异，热应激组的IL-2和IL-1β含量相对空白组显著上升(P<0.01，P<0.05)，柴胡口服液各剂量组的IL-1β含量相对热应激组均显著性降低。热应激第10天，各组肉鸡血清中的IL-2和IL-1β含量无显著差异，而热应激组IL-6和TNF-α含量相对空白组极显著增加(P<0.01，P<0.01)；与热应激10天组相比，柴胡口服液各剂量均能显著降低肉鸡血清中IL-6和TNF-α水平(图1)。

与空白组相比,#P<0.05，# #P<0.01；与热应激组相比,*P<0.05，**P<0.01 vs.control group,#P<0.05,##P<0.01 ; vs.heat stress group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 热应激肉鸡肺脏组织病理变化

空白组的肺脏肺泡结构明显，肺间质无明显充血；热应激第5天，肺泡结构明显扩张，热应激第10天，组织间隙显著出血；阳性药物组热应激第5天可见血管少量充血，第10天血管出血更加明显；柴胡口服液各剂量组的肺泡结构相对正常，充血、出血现象较少(图2)。

2.3 热应激肉鸡肺组织重量变化

与正常组相比，热应激第5天与第10天均能显著增加肉鸡肺指数(P<0.01，P<0.05)，而阳性药物及柴胡口服液5天组均能显著降低肉鸡肺指数，阳性药物及柴胡口服液各剂量10天组对肺指数无明显影响，说明柴胡口服液5天组能显著降低热应激引起肺水肿，对热应激肉鸡肺脏有一定保护作用(图3)。

2.4 热应激肉鸡肺脏中IL-6和TNF-α蛋白的表达

与空白组相比，热应激第5天组肉鸡肺脏中IL-6和TNF-α表达量极显著上升(P<0.01)，而药物组和柴胡口服液剂量组均能显著降低肺组织中IL-6和TNF-α的含量。与空白组相比，热应激第10天组肉鸡肺脏中IL-6表达量显著上升，而TNF-α含量显著下降；与热应激10天组相比，阳性药物组的IL-6含量显著上升，仅柴胡口服液高剂量组的IL-6和TNF-α的表达呈显著下调(图4)。

A.空白对照组；B.热应激组；C.阳性药物组；D.柴胡低剂量组；E.柴胡中剂量组；F.柴胡高剂量组； A.Control group; B.Heat stress group; C.Positive group; D.RBO-low group; E.RBO-mid group; F.RBO-high group图2 柴胡口服液对热应激肉鸡肺组织病理学变化的影响(HE，40×)

2.5 热应激肉鸡肺脏组织中NLRP3和IL-1β表达

与空白组相比，热应激5天组肉鸡肺组织中NLRP3表达量显著上调(P<0.01)，IL-1β含量在热应激第5天和第10天时均显著增加(P<0.01，P<0.01)；与热应激组相比，阳性药物组和柴胡口服液各剂量组均能降低第5天和第10天肉鸡肺组织中NLRP3和IL-1β的蛋白表达(图5)。

2.6 热应激肉鸡肺组织中NF-κB p65及磷酸化蛋白含量

与空白组相比，热应激第5天和第10天组肉鸡肺组织中磷酸化p-65蛋白与非磷酸化p-65表达比例显著增加，与热应激组相比，阳性药物组仅在热应激第5天下调了磷酸化p-65蛋白的表达，而柴胡口服液各剂量组均能显著下调第5天和第10天热应激肉鸡肺脏中磷酸化p-65的蛋白表达(图6)。

3 讨论

慢性热应激可导致鸡肺泡结构紊乱，与鼠的急性肺损伤的得到的结果相似[8]，且随着热应激时间的延长，出现明显的出血和充血现象，而经柴胡口服液治疗后，可减轻热应激所致的肺损伤，说明柴胡口服液能预防和缓解热应激。

与空白组相比,#P<0.05，# #P<0.01；与热应激组相比,*P<0.05，**P<0.01 vs.control group,#P<0.05,##P<0.01; vs.heat stress group,*P<0.05,**P<0.01

#P<0.05，# #P<0.01，与空白组相比；*P<0.05，**P<0.01与热应激组相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P< 0.01,vs.heat stress group.

慢性热应激对机体的影响还体现在引起血清中IL-6、IL-2、IL-1β和TNF-α的变化[9]以及提高IL-6和TNF-α等促炎基因mRNA的表达[10]。热应激第5天时，血清中IL-2和IL-1β的含量增加，而在热应激第10天时，IL-6和TNF-α的升高，说明在热应激期间不同的炎性因子在不同时期起作用。IL-6具有诱导B细胞的分化产生免疫球蛋白[11]、激活NK细胞的功能 ，可以被IL-1β和TNF-α诱导表达，同时又能抑制IL-1β和TNF-α的过度表达，在炎症反应中具有促炎及抗炎作用。IL-2可与IFN-β共同诱导淋巴细胞活化杀伤细胞的杀伤活性，促进T细胞表达IL-2受体，增加机体对病原体的抵抗力，加速对外来病源体的清除。

核因子-κB(NF-κB)是机体中普遍存在的转录因子，一般以两个蛋白亚基p65(RelA)和p50(NF-κB)组成异源二聚体的形式与IκB结合存在于细胞质中，此时无转录活性。当机体受到外来刺激或者体内的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α刺激时，可活化NF-κB进入细胞核，与核内靶基因启动子特定基因序列结合，激活炎性级联反应，在肺脏炎症反应中起关键作用。炎症小体(NLRP3)的激活需要先经过Toll样受体识别危险相关的分子模式或病原体相关的分子模式激活NF-κB的和诱导Pro-IL-1β的生成才能进行启动，随后在各种细胞外刺激下触发炎症复合体的组装才能最终激活产生具有生物活性的IL-1β[12]。本文证明热应激前期可明显促进肉鸡肺脏NF-κB p65蛋白及其磷酸化蛋白的表达，促进炎性相关因子NLRP3、IL-1β、IL-6和TNF-α的积累，表明慢性热应激可能激活了NF-κB信号通路，促进下游IL-6和TNF-α的表达，同时还激活了NLRP3，促进IL-1β的表达，柴胡口服液可通过抑制上述过程减轻热应激造成的炎性损伤。

#P<0.05，# #P<0.01，与空白组相比；*P<0.05，**P<0.01与热应激组相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P<0.01,vs.heat stress group.

#P<0.05，# #P<0.01，与空白组相比；*P<0.05，**P<0.01与热应激组相比。 #P<0.05,##P<0.01 vs.control group; *P<0.05,**P<0.01,vs.heat stress group.

慢性热应激可诱导肉鸡肺部炎性损伤，而柴胡口服液可能通过抑制NF-κB-NLRP3信号通路减少炎性因子表达从而缓解热应激引起的炎性损伤，表明柴胡口服液具有明显的抗热应激效果，可用于临床上家禽慢性热应激的预防和治疗。