犬腹主动脉瘤模型的快速建立

明东东，徐在品,李思南，王 瑶，李胤霆，杨芸芸，李芳芳

(贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025)

腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm，AAA)是一种常见的动脉扩张性疾病，表现为腹主动脉局部持久扩张超过原来正常动脉直径的50%以上[1]。AAA一旦发生破裂，将导致主动脉大量出血，其致死率达60%～80%[2]。AAA的形成是遗传、环境、生物化学、炎症、解剖结构和生物力学等诸多因素共同作用的结果。腹主动脉瘤典型的病理表现有主动脉中膜和外膜炎性细胞浸润，弹力纤维断裂、降解，细胞外基质受损等[3]。AAA形成的本质普遍认为是腹主动脉管壁中膜结构和负荷失衡，不能抵抗管腔内血流压力而发生的阶段性扩张[4]。弹力蛋白酶灌注是腹主动脉瘤疾病模型最常用的方法[5]，这些大量的弹力蛋白酶使弹力蛋白的降解率异常升高，引起主动脉壁内弹力连接组织裂解，加快腹主动脉的扩张速率。动物疾病模型对于研究其发病机制、疾病进展及评价相关治疗方案有重要意义。腹主动脉瘤建模包括遗传倾向性疾病模型、化学诱导性疾病模型、血流动力学诱导性疾病模型等。实验动物主要包括大鼠、小鼠、兔、犬、猪、羊。每种实验动物都有其优缺点，犬主动脉形态与人类相似度高，适用于腔内治疗相关研究。但目前已有的犬腹主动脉瘤模型制作周期需要3个月～4个月，严重影响腔内治疗研究的进度[6]，犬腹主动脉瘤腔内治疗在宠物疾病治疗中具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 健康中华田园犬，已免疫，体重10 kg～15 kg。随机分成对照组(生理盐水)和试验组(弹力蛋白酶)，每组3只，共6只。试验用动物单笼饲养，采食和饮水自由。

1.1.2 主要试剂与仪器 舒泰50(6CKX),法国维克有限公司产品;弹力蛋白酶(20180206)，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；动物麻醉机和动物呼吸机，美国Matrx有限公司产品；生理监护仪，深圳迈瑞医疗有限公司产品；兽用彩色多普勒超声仪，飞依诺科技(苏州)有限公司产品；切片机，德国徕卡仪器有限公司产品；冻台，武汉俊杰电子有限公司产品；组织摊片机，浙江金华科迪仪器设备有限公司产品；正置光学显微镜，日本尼康公司产品。

1.2 方法

1.2.1 测量犬腹主动脉 犬右腹部剃毛，使用VINNO6兽用彩色超声诊断仪，F4-12L探头，将频率调至3.2 MHz，对犬进行腹主动脉超声检查。观察并记录犬腹主动脉原始管径与血管扩张变化情况，直至犬腹主动脉瘤形成，并对血管扩张情况进行统计学分析。

1.2.2 血常规检查 犬前肢头静脉采血，收集于抗凝血管中，进行血常规检查。每天记录试验组与对照组血常规检查结果，并对炎性细胞进行统计学分析。

1.2.3 制作犬腹主动脉瘤 舒泰50按照犬5 mg/kg～10 mg/kg静脉注射，麻醉后仰卧保定。切口沿脐下腹中线切开5 cm左右，填塞大纱布，向右上方推开脾脏和肠管，腹腔自动牵开器暴露手术部。在肾下腹主动脉下端和髂总动脉上端，切开后腹膜，钝性分离犬腹主动脉2 cm左右。用一次性注射器将5 mL弹力蛋白酶(100 IU/mL)注入犬腹主动脉中膜(图1)，生理盐水冲洗后，闭合腹腔。术后连续3 d肌肉注射氨苄西林(160万U/次，1次/d)，7 d后拆除皮肤缝线。

图1 犬腹主动脉中膜灌注弹力蛋白酶

1.2.4 HE和EVG染色 犬腹主动脉瘤形成后，处死试验犬，剖检取出腹主动脉损伤段进行组织固定、包埋、HE染色。病理组织学观察主动脉壁组织结构及炎性细胞浸润情况，EVG染色观察犬腹主动脉瘤管壁弹力纤维破坏程度。

2 结果

2.1 犬腹主动脉瘤超声图像

浸润前3只犬腹主动脉管壁均呈强回声影像，波动感明显，边界清晰，管壁较薄。沿腹主动脉向髂总动脉端移动，纵断面(图2A)血管内径与外径前后一致，横断面(图2B)血管管壁厚度不变。形成腹主动脉瘤时，犬腹主动脉管壁呈强回声，与浸润前相比回声明显减弱。浸润部位血管内径轻微扩大或不变，管壁厚度显著增加(P<0.05)，血管平均扩张1.61倍。沿腹主动脉向弹力蛋白酶浸润端移动，纵断面(图2C)血管内径逐渐扩大或不变，血管外径逐渐增大。横断面(图2D)血管管壁厚度差异较大，表现为血管一侧厚度显著变薄(P<0.05)，管壁厚度平均缩小0.76倍。

2.2 犬腹主动脉瘤病理组织学观察

对照组犬腹主动脉管径前后不变(图3A)，未见组织炎性水肿(箭头所示)。试验组3只犬腹主动脉均发生肉眼可见扩张(图3B)，弹力蛋白酶作用部位与正常血管相比，弹力蛋白酶作用部位的组织可见明显的炎性水肿，并且扩张部位往往偏向一侧(箭头所示)，方向没有固定性。

A.正常犬腹主动脉纵断面；B.正常犬腹主动脉横断面；C.犬腹主动脉瘤纵断面；D.犬腹主动脉瘤横断面

2.3 犬腹主动脉血管直径变化结果

术后1 d～2 d，各组犬腹主动脉血管的外径均发生不同程度的炎性扩张，血管内径基本不变或轻微扩张。对照组犬腹主动脉管径在术后3 d恢复正常水平，始终保持与原始管径基本一致。试验组的犬腹主动脉管径在术后2 d达到最高值，犬腹主动脉管径扩张1.70倍，与对照组差异显著(P<0.05)。术后5 d，犬腹主动脉血管外径逐渐开始扩张。术后8 d，试验组3只犬均形成犬腹主动脉瘤，血管管径扩张1.61倍，与对照组差异显著(P<0.05)。

2.4 血常规检查结果

术后1d～2 d，各组白细胞总数(WBC)均较术前升高14%～61.12%，淋巴细胞(LYM)数量均无明显变化，其中试验组中性粒细胞(NEU)和单核细胞(MON)数量均较术前显著升高(P<0.05)。术后3 d～8 d，对照组各项指标均恢复至术前水平，试验组各项指标保持在较低水平(表2)。

A.对照组犬腹主动脉；B.试验组犬腹主动脉瘤

表1 犬腹主动脉管壁直径变化结果

表2 血常规检查结果

2.5 犬腹主动脉瘤病理组织学观察

对照组犬腹主动脉(图4A)HE染色，可见血管平滑肌细胞(EMSAs)排列整齐，血管壁结构清晰，组织致密，血管内皮细胞(ECs)较少。试验组(图4B)可见中膜结构严重破坏，EMSAs明显减少，细胞排列紊乱。血管中膜弹力板各层细胞间隙明显增大，并伴随广泛炎性细胞浸润(图4C)。

2.6 犬腹主动脉瘤EVG染色观察

对照组犬腹主动脉(图5A)EVG染色，均可见弹力纤维连续完整，弹力板层次清晰，结构紧密，曲度明显。试验组犬腹主动脉中膜弹力纤维出现断裂和碎片(图5B)，弹力板层数减少，原有曲度改变。血管中外膜内的胶原纤维和弹力纤维间隙增大，中膜层裂解，甚至形成空隙。

A.对照组犬腹主动脉(100×)；B.试验组犬腹主动脉瘤(100×)；C.犬腹主动脉瘤组织内炎性细胞(200×)

A.对照组犬腹主动脉(100×)；B.试验组犬腹主动脉瘤(100×)

3 讨论

建立理想的实验性AAA疾病模型能够更好地了解AAA形成机制，并有利于微创腔内技术及药物治疗研究。在AAA腔内治疗研究领域需要一种血管直径较大、渐进性生长、病理特征相似的AAA动物疾病模型[7]。犬主动脉形态接近人类且外周动脉粗大，便于将输送系统经股动脉放置血管内覆膜支架，在腹主动脉瘤腔内治疗方面具有优势。

弹力蛋白酶灌注是AAA啮齿类动物疾病模型最常用的方法[8-10]，通过犬腹主动脉加压灌注弹力蛋白酶能够在3个月形成稳定的腹主动脉瘤，成瘤率68%[11]。本试验将弹力蛋白酶直接作用于腹主动脉管壁中膜的弹力纤维，影响动脉管壁弹力链接组织的完整性，从而导致腹主动脉壁中膜结构和负荷失衡，不能抵抗管腔内血流压力而发生的阶段性扩张。通过兽用彩色多普勒检查发现AAA增长速度并不是线性相关[11]，犬AAA扩张过程存在2个平台期：第1个平台期(1 d～3 d)，外源性弹力蛋白酶引起腹主动脉中膜弹力回缩缺失以及急性炎症，导致血管管径显著扩张。随着急性炎症的消退，从而进入下一个平台期；第2个平台期(4 d～8 d)，平滑肌细胞( smooth muscle cell,SMC)的急性炎性损伤，导致腹主动脉壁修复能力减弱，并且在腹主动脉缺乏滋养血管和内皮细胞下层变厚的情况下，仅靠管腔内血液弥散容易进一步导致腹主动脉中膜SMC缺血坏死，从而导致犬AAA形成。弹力蛋白是动脉壁承受压力负载的关键因素，弹力蛋白的降解是动脉形成瘤样扩张的关键起始步骤，腹主动脉中膜SMC损伤情况是动脉形成瘤样扩张速度的关键因素[12]。

本试验中犬AAA疾病模型的制作方法的原理是将弹力蛋白酶灌注于腹主动脉管壁中膜的弹力板层，直接引起主动脉壁内弹力连接组织裂解，导致动脉壁无法承受血压而发生渐进性的瘤样扩张。该方法降低了手术的难度，缩短手术时间约20 min，有效保证动物成活率。但目前对于腹主动脉瘤形态不能进行有效的控制，可以从弹力蛋白酶的灌注部位和灌注量的角度研究控制瘤样扩张的形态和速度。本文制作的犬AAA疾病模型从形态学角度看，犬腹主动脉呈渐进性扩张并于8 d～9 d达到AAA形态学标准，成瘤时间短，成瘤率较高。从病理学方面看，弹力蛋白酶中膜灌注组符合AAA基本病理变化，即主动脉中膜和外膜炎性细胞浸润，弹力纤维断裂、降解，细胞外基质受损等。从试验组和对照组的病理变化可以发现，急性炎性反应短期内可以促进AAA的形成，但在腹主动脉渐进性扩张过程并非关键因素，腹主动脉壁中膜结构和负荷失衡是AAA快速形成的关键；腹主动脉的扩张可能是一种腹主动脉管壁的重建过程，腹主动脉壁中膜SMC数量和功能的变化在病变再塑形的血管壁中起重要作用。通过本试验可以推测腹主动脉扩张的速度关键因素取决于腹主动脉壁中膜结构和负荷失衡的情况，另一个重要因素是腹主动脉壁中膜SMC重建过程，这两个因素的联合下，腹主动脉发生渐进性扩张。但关于腹主动脉扩张过程中的2个平台期，腹主动脉壁中膜SMC在病变再塑形分别所起的作用有待进一步研究。