人工饲喂芽孢杆菌的哈萨克羔羊肠道形态结构研究

2022-04-11彭凡洋赛务加甫冷青文

动物医学进展 2022年3期

彭凡洋，赛务加甫，冷青文

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003)

芽孢杆菌作为新型动物微生态饲料添加剂，具有无毒副作用、代谢快和稳定性高等优点[1-2]。芽孢杆菌在微生态制剂中以内生孢子形式存在，进入动物肠道后，孢子在肠道能迅速定繁并分泌活性强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，有助于肠道对营养物质的消化吸收，产生细菌素拮抗肠道致病菌，通过生物夺氧消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，有利于维持肠道的生态平衡[3-4]。本试验主要研究芽孢杆菌对新疆哈萨克羔羊肠道结构发育的影响，为芽孢杆菌在绵羊生产中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物与菌株来源 3月龄健康、体质量相近的新疆哈萨克羔羊28只，雌雄不限，购于伊犁哈萨克种羊场。芽孢杆菌HS06菌株为石河子大学动物科技学院生物实验室留存菌种。

1.1.2 主要试剂免疫组化(IHC)试剂盒套装(抗兔)、IL-6兔单克隆抗体、生物素标记羊抗兔IgG抗体、试剂均为北京博奥森生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器超净工作台(SW-CJ-1F)，苏州安泰空气技术有限公司产品；恒温振荡器培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；石蜡包埋与切片机，德国徕卡公司产品；摊片机(KD-T)，浙江科迪仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理采用单因子设计，将24只3月龄的健康新疆哈萨克羔羊，随机分为2组，对照组饲喂基础日粮并灌服生理盐水；试验组(BL)羔羊灌服不少于108CFU以上芽孢杆菌HS06溶液[5]。试验共21 d，其中适应期6 d，预饲期7 d，正式试验期14 d，日喂2次菌液，自由采食饮水。

1.2.2 菌悬液制备芽孢杆菌HS06接种至LB营养肉汤内，37℃培养1 d后，平板菌落计数法检测显示芽孢杆菌HS06菌液约为13×108CFU/mL。

1.2.3 样品采集试验第20天，用抹脖法放血屠宰羔羊，迅速剖开腹腔，分别切取十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠2 cm～3 cm组织块，用9 g/L生理盐水漂洗，组织块置于40 mL/L多聚甲醛液(0.1 mol/L，pH7.2)中固定24 h。

1.2.4 HE染色常规石蜡包埋，制备连续切片，厚度5 μm。将肠道切片置于新鲜二甲苯中脱蜡2次，每次5 min。脱蜡后，依次放入无水乙醇2 min、950 mL/L乙醇2 min、850 mL/L乙醇2 min、700 mL/L乙醇2 min。蒸馏水洗2～3次。苏木精染核2 min～3 min，蒸馏水中略洗，再进入盐酸酒精分化20 s。在流水中放置10 min～15 min。伊红溶液染胞质10 s。将切片依次放入950 mL/L乙醇2 min、950 mL/L乙醇2 min、无水乙醇2 min、无水乙醇2 min。二甲苯透明5 min，重复2次。用中性树胶封片。

1.2.5 免疫组织化学染色免疫组化染色按照试剂盒说明进行，石蜡切片脱蜡水化，用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。置于柠檬酸抗原修复缓冲液中用微波炉热修复，冷却至室温后取出。在室温下用内源性过氧化物酶阻断剂孵育30 min。切片用山羊血清37℃封闭20 min。擦干切片上多余液体，滴加一抗( 1∶500 )后切片于湿盒37℃孵育1 h～2 h,用PBS缓冲液做一抗的阴性对照组；0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗5 min×3次。滴加生物素标记的羊抗兔IgG 37℃，20 min，0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗5 min×3次；滴加SABC试剂37℃孵育20 min，0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗5 min×3次；DAB显色：显微镜下控制时间，暗处反应3 min～5 min，水洗；并用苏木精复染1 min～5 min，自来水冲洗后。置于溶液中脱水透明后用中性树脂封片。在光镜下，蓝色为细胞核，棕黄色为阳性表达。

1.2.6 检测指标将肠道切片在光镜下观察拍照，分别比较各组羔羊肠道组织形态结构，并用图像分析系统进行肠道形态学观察。检测每组羔羊不同肠段的绒毛长度、黏膜厚度以及肌层厚度，每张切片选取5个视野，每个视野内选取至少5个计数，取平均值[6],并测量IL-6阳性反应的光密度值，取平均值。

1.2.7 数据分析用SPSS23.0软件进行单因素方差分析，数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 饲喂芽孢杆菌对羔羊体重的影响

通过两组羔羊分别灌服芽孢杆菌和生理盐水14 d后发现，灌服芽孢杆菌的羔羊体重增长速度明显高于对照组(P<0.01，差异极显著)，特别是灌服7 d后，羔羊呈现代偿性生长，增长迅速，说明芽孢杆菌对健康羔羊体重的发育影响较大(图 1)。

图1 羔羊体重变化

2.2 饲喂芽孢杆菌对羔羊小肠形态结构的影响

由表1可知，相较对照组，试验组羔羊十二指肠、空肠和回肠绒毛长度、黏膜厚度以及肌层厚度皆极显著增加(P<0.01)(图2～图4)。

表1 芽孢杆菌对羔羊小肠形态结构的影响

2.3 芽孢杆菌对羔羊大肠形态结构的影响

由表2可知，相较对照组，试验组羔羊盲肠、结肠和直肠绒毛长度、黏膜厚度以及肌层厚度皆显著增加(P<0.05)(图5～图7)。

2.4 饲喂芽孢杆菌对肠道组织IL-6表达的影响

各组羔羊肠道组织中IL-6的分布情况见图8～图14。在对照组，羔羊小肠内IL-6强表达于黏膜固有层，弱表达于黏膜上皮层、黏膜下层和肌层，浆膜不表达；羔羊大肠内IL-6强表达于黏膜固有层，弱表达于黏膜上皮层，黏膜下层以及肌层显示阳性反应，浆膜不表达。试验组IL-6强表达于羔羊小肠的黏膜上皮层和黏膜固有层，弱表达于肌层，黏膜下层显示阳性反应，浆膜无表达；羔羊大肠内IL-6强表达于黏膜上皮层和黏膜固有层，黏膜下层以及肌层显示阳性反应，浆膜不表达。

2.5 肠道各段黏膜固有层中免疫反应IL-6光密度值分析

由表3可知，IL-6在羔羊小肠黏膜固有层中的光密度值高于大肠中IL-6的光密度值。与对照组相比，试验组IL-6在羔羊十二指肠、空肠和结肠黏膜固有层的光密度值皆显著增高(P<0.05)；其余肠道有增加的趋势，但差异不显著(P>0.05)。因此可推测，IL-6在羔羊肠道中主要活动区域分布于羔羊小肠中，在结肠有部分分布，盲肠和直肠较少分布；给羔羊喂食芽孢杆菌后，能够提高羔羊肠道中IL-6的阳性表达，增加羔羊IL-6的分泌。

→黏膜上皮层；▲黏膜固有层；●黏膜下层；◆肌层；bar=100 μm

图2 芽孢杆菌对十二指肠微细结构的影响(50×)

Fig.2 Effects ofBacillusfeeding on microstructure of duodenum(50×)

→黏膜上皮层；▲黏膜固有层；●黏膜下层；◆肌层；bar=100 μm

图5 芽孢杆菌对盲肠微细结构的影响(50×)

Fig.5 Effects ofBacillusfeeding on microstructure of caecum(50×)

→黏膜上皮层；▲黏膜固有层；●黏膜下层；◆肌层；bar=100 μm

3 讨论

芽孢杆菌为口服给药的活微生物，可通过改善宿主动物的肠道平衡产生有益影响[6-7]。芽胞杆菌具有较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，在反刍动物中，芽孢杆菌的孢子与瘤胃中的微生物群相互作用，提高肠道内营养物质的消化吸收。肠道的绒毛长度、黏膜厚度及肌层厚度是衡量肠道消化吸收功能的重要指标[8]，当绒毛长度增加时，会增强肠的消化吸收功能；肠道黏膜越厚，肠道发育越完善，消化能力越强[9]；黏膜和肌层的增厚，会促进营养物质的吸收和转运[10]。本研究发现，饲喂芽孢杆菌对羔羊发育有着明显的促进作用，饲喂芽孢杆菌后，羔羊肠道不同肠段绒毛长度、黏膜厚度及肌层厚度的显著增厚；小肠的增长显著高于大肠，并加快了羔羊的生长速度。由此可知，芽孢杆菌能够改善羔羊肠道的结构形态，促进营养物质的吸收和转运，增强肠道对营养物质的消化吸收功能，促进羔羊的生长。

表2 羔羊大肠形态结构观察结果

→黏膜上皮层；▲黏膜固有层；●黏膜下层；◆肌层；bar=100 μm

IL-6也叫B细胞生长因子，是机体为保持内环境稳定而分泌的一种多功能细胞因子，能够促进B细胞增殖分化和免疫球蛋白分泌，促进杀伤性T细胞分化并提高其功能[11]。IL-6在机体免疫反应调节和免疫防御反应中起到重要的作用，是分析机体免疫功能的重要指标[12]。本研究结果显示，与对照组相比，试验组IL-6强表达于羔羊肠道的黏膜上皮层和黏膜固有层，黏膜下层以及肌层显示阳性反应，浆膜不表达。说明IL-6在羔羊肠道各段皆有分布，肠道黏膜上皮层和黏膜固有层可视为IL-6参与肠道免疫的主要部位。IL-6在羔羊小肠黏膜固有层中的光密度值高于大肠中IL-6的光密度值，说明肠道的免疫反应集中在小肠，芽孢杆菌能够大量定殖于小肠，小肠能够识别芽孢杆菌并进行相互作用，提高小肠内IL-6的分布；大肠中IL-6的阳性反应略少，可能与大肠的功能有关，芽孢杆菌只能少量定殖于大肠。与对照组相比，试验组IL-6在羔羊小肠中十二指肠和空肠黏膜固有层的光密度值皆显著增高(P<0.05)，说明十二指肠和空肠可视为小肠免疫反应的主要区域，能够快速有效地与芽孢杆菌产生反应，提高IL-6的分泌，增强小肠的免疫能力。与对照组相比，试验组IL-6在羔羊结肠黏膜固有层的光密度值显著增高(P<0.05)，说明结肠是大肠免疫反应的主要部位，能够略为灵敏地识别芽孢杆菌，提升IL-6的分泌，增强大肠的免疫能力。