新疆6个地区规模化猪场猪圆环病毒3型感染调查和基因分析

李 静，屈勇刚*，张家瑞，常军帅，杨瑞钰，周磊磊，王紫阳，孙琼飞，张鲁安

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐 830063)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是目前发现最小的动物病毒。2016年前只发现猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)两种基因型[1]。PCV1可以感染猪但无致病性，PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)主要病原[2-3]。用宏基因组等技术从患有皮炎肾病综合征和繁殖障碍母猪及流产胎儿体内鉴定出一种新型的猪圆环病毒，能够感染猪心脏和多系统炎性浸润等病理变化，被命名为PCV3[4]。PCV3基因组为2 000 bp，包括3个主要的开放阅读框(ORF)，其中ORF1基因编码复制酶蛋白(Rep)，由297个氨基酸组成[5]；ORF2与ORF1方向相反，编码衣壳蛋白(Cap)，由214个氨基酸组成[6]；ORF3 编码的蛋白由231个氨基酸组成，其转录方向与ORF1一致，编码蛋白的功能尚需验证。Cap蛋白是PCV3的主要结构蛋白和抗原蛋白。根据PCV3全基因组序列和Cap蛋白突变氨基酸A24V和R27K，将PCV3分为PCV3a、PCV3b和PCV3c等3个基因型[7-9]。2016年起韩国、巴西、波兰、意大利等多个国家和地区陆续报道了PCV3，我国猪群感染PCV3的情况也很普遍，已有28个省市报告存在PCV3。为了调查新疆地区PCV3的感染情况，本文采集新疆部分地区449份猪组织样品进行PCV3核酸检测，为新疆部分地区PCV3的防控工作提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2019年9月至2020年12月采集新疆6个地区(阿克苏、巴州、石河子、奎屯、克拉玛依、伊犁)规模化养猪场猪样品449份，有全血433份，组织16份(表1)。对石河子地区采集的163份样品记录了不同生长阶段(表2)。将样品于-80℃冰箱保存备用。

1.1.2 主要试剂与仪器 Trans1-T1感受态细胞、pEASY-T1 Simpie Cloning Kit、Trans Script® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for PCR，北京全式金生物技术公司产品；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品；Fast Pure® Gel DNA Extraction Mini Kit、2×Taq Plus Master Mix、DL Marker Ⅰ，北京全式金生物技术有限公司产品；核酸电泳仪，英国Bibby科技有限公司产品；离心机，赛默飞世尔科技有限公司产品；低温冰箱，海信容声冰箱有限公司产品。

表1 PCV3样品来源情况

表2 不同年龄段猪样品情况

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参照文献[10-13]合成套式PCR检测引物PCV3-F1/R1和PCV3-F2/R2，扩增片段分别为620 bp和329 bp；PCV2检测引物PCV2-F1/PCV2-R1扩增片段487 bp；猪伪狂犬病病毒(PRV)检测引物PRV-F1/PRV-R1扩增片段295 bp；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测引物PRRSV-F1/R1扩增片段433 bp；根据国家标准合成猪瘟病毒(CSFV)检测引物CSFV-F1/F2，扩增片段585 bp。引物均由北京华大基因科技有限公司合成，用前将引物浓度稀释至10 μmol/L(表3)。

1.2.2 病毒核酸提取 取200 μL血液，不足200 μL可加缓冲液GA补足，病料组织研磨，处理为细胞悬液，10 000 r/min离心1 min，倒尽上清，加200 μL缓冲液GA，根据DNA/RNA提取试剂盒说明书对采集的样品进行病毒基因组DNA/RNA提取，按照反转录试剂盒说明书进行，取4 μL提取的总RNA为模板加入RNase-free Water 12 μL混匀，于65℃水浴锅中孵育5 min，之后冰浴2 min，加入4 μL 5×Trans Script® All-in-One Super Mix for PCR 42℃孵育30 min，85℃水浴锅中孵育5 s，反应结束后置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 PCV3、PCV2、PRV的PCR检测 用特异性引物对提取样品的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系20 μL：ddH2O 7 μL，2×Taqplus Master Mix10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCV3 PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃终延伸10 min。PCV2 PCR反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环；72℃终延伸10 min。PRV PCR 反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，61℃ 40 s，72℃ 30 s，35 个循环；72℃终延伸 10 min。反应结束后各取7 μL PCR扩增产物，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。统计分析PCV3病毒的单独感染和混合感染。

表3 引物序列

1.2.4 PRRSV、CSFV的RT-PCR检测 用特异性引物对提取样品的cDNA进行PCR扩增，PCR反应体系同1.2.3，PRRSV PCR 反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 60 s，57℃ 60 s，72℃ 60 s，34个循环；72℃终延伸10 min。CSFV PCR反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 50 s，58℃ 60 s，72℃ 35 s，40个循环；72℃终延伸5 min。电泳检测及分析同1.2.3。

1.2.5 PCV3扩增产物回收纯化及测序 将PCV3检测阳性，其他病毒检测为阴性的样品，经PCR扩增后用Fast Pure® Gel DNA Extraction Mini Kit进行凝胶回收纯化，将回收产物连接至T载体，转化入Trans1-T1感受态细胞，挑取单个菌落培养并进行PCR鉴定，阳性菌液送北京华大基因科技有限公司测序。

1.2.6 测序分析 用Meg Align软件对分离株与国内外PCV3序列进行同源性分析，用MEGA7.0软件构建遗传进化树，所有参照序列的PCV3基因组从NCBI基因库下载。

2 结果

2.1 不同地区PCV3 PCR检测

对采自6个不同地区规模化养猪场的449份血样进行PCV3基因检测，凝胶电泳结果显示，出现1条329 bp的阳性条带，与目的片段大小一致(图1)。共检测出PCV3阳性样品65份，平均阳性率为14.5%(65/449)。各地区均检测到PCV3，阳性率为8.1%～16.0%，其中石河子地区16.0%，伊犁地区8.1%(表4)。对不同地区PCV3感染情况通过χ2检验，P>0.05，即差异性不显著。

M.DNA标准DL 700；1～7.PCV3阳性样品；N.阴性对照；P.阳性对照

表4 不同地区PCV3 PCR检测结果

2.2 PCV3与其他猪源病毒混合感染情况

对PCV3基因检测为阳性的样品(65份)同时进行PCV2、PRV、PRRSV、CSFV基因检测，除CSFV 外其余病毒均出现阳性条带与预期结果一致，大小分别为487、295、433 bp(图2)。对PCV3阳性样品及其常见病原的基因检测结果进行统计，PCV3单独感染率为33.8%(22/65)，PCV3与其他病原的二重感染中，PCV3+PRRSV感染率为16.9%(11/65)、PCV3+PCV2感染率为15.4%(10/65)；PCV3与其他病原的三重感染中，主要以PCV3+PCV2+PRRSV为主，感染率为15.4%(10/65)；PCV3与所调查的病原四重感染较少，PCV3+PCV2+PRV+PRRSV感染率为1.5%(1/65)(表5)。

2.3 不同生长阶段猪群PCV3 PCR检测

石河子地区不同生长阶段猪群感染PCV3的平均阳性率为16.0%(26/163)，其中保育猪的阳性率为30.0%(12/40)，育肥猪阳性率为5.3%(2/38)(表6)。对不同生长阶段猪群感染PCV3进行χ2检验，P<0.05，即差异显著。

M.DNA标准DL 700；1、4、7.PCV2、PRV、PRRSV阳性样品；2、5、8.阳性对照；3、6、9.阴性对照。10～11.CSFV阴性样品和阴性对照

表5 PCV3与其他常见病原混合感染情况

表6 不同年龄段PCV3 PCR检测结果

2.4 PCV3序列测定与分析

测序结果表明，样品基因片段与目的片段大小一致(329 bp)，用NCBI、DNA Man、MegAlign软件对获得的PCV3核苷酸序列与国内外14株PCV3基因序列进行同源性比对，结果本试验获得的PCV3核苷酸序列与国内外参考毒株同源性为97.9%～100.0%，其中与中国河北株KY 354060.1PCV3-CN-Hebei-33-2016同源性为100%，与中国浙江株 MK033237.1 PCV3-CN-ZJ-QZ-2-2016同源性为97.9%；与意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016同源性为99.7%，与俄罗斯株MG 679916.1PCV3-RU-TY17同源性为98.6%，PCV3-25为试验所得序列(图3)。

用MEGA 7.0软件将本试验获得的PCV3基因序列与国内外14株PCV3参考基因序列共同建立遗传进化树。本试验获得的PCV3-25与意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016、河北株KY354060.1 PCV3-CN-Hebei-33-2016、浙江株MK033223.1 PCV3-CN-ZJ-JH-2017、重庆株KY075991.1 PCV3-CN-Chongqing-148-2016、江西株KY075989.1 PCV3-CN-Jiangxi-62-2016、福建株MF589108.1 PCV3-CN-Fujian-FZ-2015、广东株MF589103.1 PCV3-CN-Guangdong-HZ4-2015在同一分支，属于3a亚群(图4)。

图3 PCV3核苷酸序列的同源性分析

3 讨论

用PCR方法对2019年9月至2020年12月采自新疆6个地区共449份组织样品进行病毒的核酸检测，结果显示PCV3平均阳性率为14.5%。新疆6个地区均检测出了PCV3的存在，检出率为8.1%～16.0%，其中石河子地区16.0%，伊犁地区8.1%，表明PCV3在新疆部分地区普遍存在，通过χ2检验对新疆不同地区PCV3感染情况进行分析，P>0.05，差异性不显著，提示猪群感染PCV3与不同地区无关。PCV3单独感染率为33.8%(22/65)，PCV3+PRRSV感染率为16.9%(11/65)；PCV3+PCV2+PRRSV感染率为15.4%(10/65)。石河子地区不同生长阶段猪群感染PCV3的平均阳性率为16.0%(26/163)，其中流产胎儿、哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、经产母猪中均检测到PCV3，表明PCV3对不同生长阶段猪群均可感染，不同生长阶段的PCV3阳性率差异显著，其中保育猪感染最为严重为30.0%(12/40)。

本研究得到的PCV3核苷酸序列与国内外参考毒株同源性为97.9%～100.0%，其中与河北株KY354060.1PCV3-CN-Hebei-33-2016同源性为100%；与意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016同源性为99.7%。本试验获得的PCV3-25与意大利株MF805722.1PCV3-Italy-2016、河北株KY354060.1 PCV3-CN-Hebei-33-2016、浙江株MK033223.1 PCV3-CN-ZJ-JH-2017、重庆株KY075991.1 PCV3-CN-Chongqing-148-2016、江西株KY0759 89.1PCV3-CN-Jiangxi-62-2016、福建株MF589108.1PCV3-CN-Fujian-FZ-2015、广东株MF589103.1PCV3-CN-Guangdong-HZ4-2015在同一分支，遗传关系较为接近，属于3a亚群。

PCV3已在多个国家和地区广泛流行，本试验结果显示该病毒在新疆部分地区存在，且与其他猪源病毒之间存在混合感染，应重视PCV3对养猪业造成的威胁。