羌活活性成分阿魏酸对猪细小病毒增殖及炎症因子表达的影响

2022-04-11郭振环李向辉张志强胡光远刘永录

动物医学进展 2022年3期

郭振环，李向辉，张志强，胡光远，赵丽，马霞,3*，刘永录

(1.河南牧业经济学院，河南郑州 450046；2.河南省中兽药经典名方传承与创新工程技术研究中心，河南郑州 450046； 3.郑州市中兽药免疫药理学重点实验室，河南郑州 450046)

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一种猪繁殖障碍性疾病[1]，不同年龄、性别的猪均易感，病毒可通过胎盘垂直传播，带毒仔猪带毒排毒时间很长甚至终身。感染种公猪通过配种传染给易感母猪。怀孕母猪易发生流产或产死胎、木乃伊胎等，临床上给母猪接种PPV疫苗预防该病毒的感染，但预防效果不理想。从中药中寻找药理作用明确的抗病毒成分防控PPV具有重要意义。羌活为伞形科植物羌活的根茎及根，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、解热镇痛及抗血栓形成等作用。主要化学成分为羌活醇、异欧前胡素、异欧前胡内酯、紫花前胡苷元、绿原酸、阿魏酸、佛手柑内酯及挥发油等成分，其中阿魏酸(ferulic acid，FA)是主要有效成分之一，具有清除自由基、抗血栓、抗炎等作用，其衍生物多为脂类、酮类、盐类等，研究发现蜂胶中阿魏酸具有抗猪细小病毒的作用。本试验检测羌活中分离的有效活性成分阿魏酸对猪细小病毒增殖及其介导炎症因子的影响，探究阿魏酸的抗炎效应，为抗病毒药物的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒 PK-15细胞系由本实验室冻存保存，PPV病毒滴度1.0×10-6TCID50/mL，由山东省滨州市畜牧兽医研究院沈志强课题组赠送。

1.1.2 主要试剂胎牛血清、DMEM培养基,2.5 g/L胰酶-EDTA、青霉素/链霉素双抗、RI-PA裂解液，碧云天生物技术有限公司产品。MTT试剂盒、荧光定量SYBR Premix ExTaq试剂盒，诺唯赞生物工程(南京)有限公司产品；羌活有效活性成分阿魏酸由郑州市中兽药有效成分免疫药理学重点实验室制备提供(纯度>95%)。

1.1.3 主要仪器 CKX53倒置显微镜，奥林巴斯株式会社产品；FormaTMSteri-CultTM二氧化碳培养箱，Varioskan LUX 多功能酶联免疫检测仪，Life Technologies 7500Fast荧光定量PCR仪，赛默飞世尔仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 阿魏酸对PK-15细胞安全浓度的测定取对数期PK-15细胞，调细胞悬液浓度约为1.0×106个/mL，加入96孔板培养24 h，吸去上清培养液，用磷酸缓冲液(PBS)洗2遍，加入全培养基2倍稀释阿魏酸有效活性成分为0、5、10、20、40、80、160、320、640、1 000 μmol/mL，继续培养48 h后弃培养基，每孔加入10 μLCCK-8溶液和90 μL无血清培养基，继续培养2 h，用酶标仪测定各孔OD450nm值，试验设空白组与阴性对照组。

细胞存活率(%)=(试验组OD450nm值-空白组OD450nm值)/(阴性对照OD450nm值-空白组OD450nm值)

1.2.2 阿魏酸最佳给药方式根据1.2.1筛选的阿魏酸安全浓度，将阿魏酸用全培养基分别配制成10、20、30、40、50 μmol/mL，方式1：药液与PPV(MOI=1)混匀后，37℃培养箱中4 h，再接种到已长成单层细胞的96孔板。方式2：向长满PK-15细胞的96孔板中每孔加入PPV(MOI=1)，置培养箱中培养4 h后加入药液；方式3：向长满PK-15细胞的96孔板中每孔加入药液，置培养箱中培养4 h后，加入PPV(MOI=1)。均继续培养24 h后，取上清液提取病毒DNA，RT-qPCR方法检测病毒增殖情况，PCR反应体系SYBR Premix ExTiqⅡ(2X)10 μL,DNA 模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：95℃ 3 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s～34 s，35个循环。

1.2.3 阿魏酸对PPV病毒增殖的抑制试验根据筛选的最佳给药方式，将长满PK-15细胞的96孔板感染PPV(MOI=1)培养4 h后给予羌活有效活性成分阿魏酸30 μmol/mL，分别在0、6、12、24、36、48 h收集病毒上清液，提取病毒DNA，用RT-qPCR方法检测病毒增殖在PK-15细胞中的增殖情况。

1.2.4 阿魏酸对PPV病毒感染PK-15细胞因子的mRNA表达水平影响将长满PK-15细胞的6孔板感染PPV(MOI=1)培养4 h后给予羌活有效活性成分阿魏酸10、20、30 μmol/mL。培养结束后，弃上清液，收集细胞，用常规trizol法提取样品总RNA，用微量核酸蛋白定量仪NanoDropTMOne/OneC检测总RNA浓度和纯度。以1 μg的总RNA为模板进行反转录，反转录体系及条件参照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒提供的方法进行。检测IL-1β、IL-2、 IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α、MIP-1α、TGF-β1、PGK1(表1)的动态表达，结束反应运用2-△△Ct法分析基因的mRNA表达量。

表1 引物序列

1.2.5 数据分析数据用SPSS21.0软件进行分析，结果以平均值士标准差 (Mean±SD)表示。

2 结果

2.1 阿魏酸对PK-15细胞的安全浓度

用0～1 000 μmol/mL的羌活有效活性成分阿魏酸分别处理PK-15细胞(图1)，在浓度低于160 μmol/mL时对PK-15细胞无毒性作用(P>0.05)，当浓度大于160 μmol/mL,细胞活力显著下降(P<0.05，P<0.01)。阿魏酸对PK-15细胞的安全浓度为0～160 μmol/mL。

*P<0.05，**P<0.01

2.2 不同给药方式对PPV病毒的抑制效果

给药方式1和3对PPV无明显抑制作用(P>0.05)。给药方式2可有效抑制PPV复制，且呈现剂量依赖性。当阿魏酸给药浓度为30 μmol/mL，病毒抑制率出现平稳状态，达到40%以上。说明阿魏酸对PPV有一定的抑制作用，主要作用于病毒感染后期(图2)。

2.3 阿魏酸对PPV病毒抑制效果

PPV随时间的增长表达量升高(图3A)，但阿魏酸浓度为30 μmol/mL能有效抑制(图3B)。与PPV(MOI=1)相比，给药组在24 h和36 h显著抑制PPV的复制(P<0.05，P<0.01，图3C)。

图2 3种不同给药方式对PPV病毒抑制效果

图3 阿魏酸对PPV病毒抑制效果

2.4 阿魏酸对IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-17和IL-18mRNA表达的影响

PPV感染PK-15细胞显著升高IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18和降低IL-17的表达(P<0.01)。在阿魏酸处理PPV感染组中，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-18显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001),IL-17显著升高(P<0.05，P<0.01)(图4)。

2.5 阿魏酸对TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1mRNA表达的影响

PPV感染PK-15细胞显著升高TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1表达(P<0.01)。阿魏酸处理PPV感染组中，TNF-α、MIP-1α、TGF-β1和PGK-1显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

3 讨论

猪细小病毒主要引起母猪繁殖障碍性疾病[2-3]，还与猪化脓性心肌炎、猪消瘦综合征及断奶仔猪多系统衰竭综合征有关[4-5]，给养猪产业带来巨大的经济损失。蜂胶提取物具有良好的抗猪细小病毒活性[7-8]，阿魏酸是蜂胶抗猪细小病毒主要活性成分[9]。

细胞因子具有调节免疫、促进细胞生长以及修复组织损伤等多种功能。病原体侵入机体后，能够触发炎症反应，激活淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子来抵抗病原体，从而减轻感染病原体引起的机体损伤，其中机体产生大量的致炎性细胞因子，如IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-8、TNF-α 及 IFN-γ等可消除病原微生物，且致炎性细胞因子能进一步激活中性白细胞、内皮细胞等，并产生氧自由基、氮氧化物、蛋白酶、花生四烯酸代谢产物等；同时机体也产生大量的内源性抗炎细胞因子，如IL-4及 TGF-β 等参与炎症反应，可见致炎性细胞因子和抗炎性细胞因子在调节病毒感染诱导的免疫平衡方面起到至关重要的作用。本试验结果发现羌活有效活性成分阿魏酸能够显著降低PPV感染PK-15诱发IL-1β、IL-2、IL-8、IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α的表达，而显著升高PPV感染PK-15诱发IL-17的表达，且与阿魏酸的给药剂量呈正相关。表明阿魏酸显著降低PPV感染细胞激活细胞炎症因子的表达水平，推测羌活有效活性成分阿魏酸具有良好的抗炎活性，可减轻炎症反应对机体的损伤从而具有抗猪细小病毒的作用。