葛根素对正常小鼠肠道微生物活度及消化酶活性的影响

黄莉莉，谭周进，朱佳源，谢果珍

（1.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

葛根素（Puerarin）属于异黄酮化合物，是葛根的主要药效成分之一[1]，葛根素药理活性广泛，尤其是控制血糖和保护心脏的功效尤为突出[2-3]，同时能改善内质网应激以阻止小鼠胰岛素瘤细胞系（MIN6）的凋亡从而有效控制糖尿病患者的血糖[4]；还能通过抑制肾上腺素受体显著降低肾上腺素引起的高血压反应[5]。以葛根素为主要成分开发的葛根素注射液[6]、消渴降糖胶囊[7]等联合西药治疗不稳定型心绞痛和糖尿病的效果显著。除了以上药理作用外，葛根素还具备解酒护肝、抗氧化、抗疲劳等保健功效。胡晓阳等[8]用葛花解酲汤灌胃治疗醉酒模型小鼠，发现葛花解酲汤能显著降低其血液乙醇浓度，证明葛花解酲汤有明显的防醉解酒作用。此外，以葛根素为主要成分开发的抗疲劳口香糖[9]和葛根果冻[10]等保健食品也深受大众喜爱。

但葛根素脂溶性低，由于其结构中的C—C 键不易被小肠中的酶水解，大部分葛根素进入人体后随粪便和尿液排出，只有少量被肝细胞色素P450 同工酶及结肠微生物分泌的代谢酶代谢为单羟基和双羟基葛根素，或者还原为大豆苷元和雌马酚等代谢物[11]。葛根素作为多种代谢酶的活性底物能对机体消化系统进行调节，有研究表明，葛根素可通过改变酶的构象抑制胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性[12-13]。然而关于其对正常机体消化系统的影响研究较少。笔者探究了葛根素对正常小鼠肠道微生物活度和消化酶活性的影响，从肠道微生物和消化酶活性的角度分析葛根素对正常小鼠消化系统的作用，以期为相关保健食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试动物 SPF 级昆明种雄性小鼠12 只，5 周龄，体质量18～22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004]，分笼饲养于湖南中医药大学动物实验中心，日常维持饲料由湖南中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2 仪器与试剂 主要仪器设备有电子天平（JA2003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、紫外分光光度计（Nano-drop2000/2000C，美国 Thermo Fisher Scientific 公司）、立式压力蒸汽灭菌器 （SQ510C，重庆雅马拓科技有限公司）、电热恒温干燥箱（202-2AB，天津市泰斯特仪器有限公司）、恒温摇床培养箱（SH2-82，金坛荣华仪器制造有限公司）、超纯水仪（PC 120COBPM1，上海威立雅水处理技术有限公司）、台式高速冷冻离心机（1850R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、涡旋混合器（VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、三用恒温水箱（HA-600，金坛市神科仪器厂）。主要试剂有荧光素二乙酸（Fluorescein diacetate，FDA，纯度≥97%，上海源叶生物科技有限公司；参考唐圆等[14]的方法配制2 mg/mL的FDA 储存液，置于棕色瓶中4℃避光保存备用）、葛根素（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）、丙酮（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司）、氯化钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）、磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、磷酸氢二钠（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将12 只小鼠适应性喂养3 d 后随机分成常规组与葛根素组，每组各6 只。小鼠适应性喂养3 d 后，参考Jeon 等[15]的给药剂量，葛根素组小鼠按10 mg/kg 的剂量灌胃，常规组小鼠给予等体积的无菌水，0.35 mL/（只·d），每天1 次，连续15 d。

1.2.2 检测指标及方法 （1）重量和摄食量。小鼠购回后称重，即为初始体重，随后每3 d 进行称重，同时记录小鼠的摄食量。（2）粪便收集。连续灌胃15 d 后，将2 组小鼠转移至干净笼盒，收集小鼠新鲜粪便，样品混合收集于已灭菌、内有玻璃珠的离心管中，离心管全程置于盛满冰的泡沫盒中，立即带回实验室，-4℃保存待检。（3）体重及各脏器称重。将小鼠禁食12 h 后称重，然后采取颈椎脱臼法处死，解剖后采集各组小鼠的肝脏、脾脏和胸腺，用滤纸吸干血液后称重，计算各脏器系数。脏器系数（%）=脏器重量（g）/小鼠体重（g）×100。（4）肠道微生物活度的测定。在装有小鼠粪便样品的离心管中加入20 mL（下同）无菌水，于振荡器上震荡5 min 使酶液充分溶出，3 000 r/min 离心15 min 后收集上清液即为粗酶液。参考谢果珍等[16]的方法用FDA 法测定粗酶液中微生物活度，每个样品平行测定3 次。（5）肠道消化酶活性的测定。制备粗酶液方法同前。纤维素酶、淀粉酶和蔗糖酶活性采用DNS 比色法[17-18]分别在540、520、540 nm 测吸光值，蛋白酶活性采用福林酚法[17]在660 nm 测吸光值，然后分别计算酶活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行统计分析。各组测得数据采用平均值±标准偏差（±s）表示，组间数据差异两两比较采用独立样本t检验，检验标准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 葛根素对正常小鼠摄食量的影响

常规组小鼠的平均摄食量在干预期呈现出一定的波动。葛根素组小鼠的平均摄食量只在干预的7～9 d稍低于常规组，其余时间均高于常规组，尤其在给予葛根素1～3 d 及13～15 d 时摄食量显著高于常规组小鼠（P＜0.05）。葛根素组小鼠的平均摄食量在葛根素干预后呈现先下降后上升的趋势，可能是由于小鼠对葛根素的摄入有一个适应期，适应期间稍抑制了摄食量，而机体适应了葛根素的摄入后，摄食量即恢复正常，并随着小鼠周龄的增加而提高。

图1 葛根素灌胃处理不同时间小鼠摄食量的变化

2.2 葛根素对小鼠体重的影响

由图2A 可知，饲养期间2 组小鼠体重均逐渐增加，葛根素组小鼠初始体重较常规组稍重，但各时期2 组小鼠的体重变化无明显差异。由图2B 可知，试验期间2 组小鼠体重增长率均逐渐降低，且葛根素组小鼠的体重增长率较常规组低（t=0.696，P=0.501），说明葛根素的摄入有降低小鼠体重增长率的趋势，有助于控制体重。

图2 葛根素灌胃处理不同时间小鼠体重（A）及体重增长率（B）的变化

2.3 葛根素对正常小鼠脏器系数的影响

胸腺和脾脏是重要的免疫器官；肝脏是能量和脂类代谢、蛋白质合成和解毒等重要生命活动的场所；脏器系数能在一定程度上反映动物内脏器官的功能状态，也被用于药物的毒性和安全性评价[19]。由表1 可知，常规组与葛根素组小鼠的胸腺指数、脾脏指数及肝脏指数无明显差异，说明葛根素的摄入对正常小鼠各器官无不良影响。

表1 葛根素灌胃处理15 d 后小鼠脏器系数的变化

2.4 葛根素对小鼠肠道微生物活度的影响

FDA 可被细菌及真菌中表达的非专一性酶催化水解产生荧光素，而微生物活度与FDA 水解酶活性成正比[20]，故通过在体外测定肠道微生物活度能在一定程度上反映微生物的代谢能力。由图3 可知，与常规组相比，葛根素组小鼠肠道微生物活度显著降低（t=4.914，P=0.037），说明葛根素摄入后可能抑制了某些微生物的生长或其功能基因的表达。

图3 葛根素灌胃处理15 d 后小鼠肠道微生物活度的变化

2.5 葛根素对小鼠肠道消化酶活性的影响

由表2 可知，与常规组相比，葛根素组蔗糖酶和蛋白酶活性均升高，但变化不显著；淀粉酶活性极显著升高；纤维素酶活性显著降低；说明葛根素的干预能降低纤维素酶活性的同时升高蔗糖酶、蛋白酶和淀粉酶的活性。消化酶的活性可以反映肠道对碳水化合物和营养物质的消化吸收功能，以上结果说明葛根素的摄入有助于小鼠肠道对蔗糖和淀粉等营养物质的降解，促进机体代谢。

表2 葛根素灌胃处理15 d 后小鼠肠道消化酶活性的变化 （U/g）

3 结论与讨论

3.1 葛根素对小鼠肠道微生物活度的影响

以FDA 水解酶的活性高低反映微生物活度的高低最初应用于土壤微生物，课题组已成熟地将FDA法用于评价动物或人体肠道微生物总体活度。该研究中，小鼠摄入葛根素后微生物总体活度显著降低，可能与葛根素抑制了某些微生物的生长，并进一步抑制其相关酶的表达有关。

3.2 葛根素对小鼠肠道消化酶活性的影响

哺乳动物的肠道是食物和药物代谢吸收的主要部位，也是众多微生物寄居的主要场所。肠道微生物群可分泌多种消化酶共同参与肠道中食物和药物的代谢吸收。药物与肠道微生物之间存在相互作用。一方面，药物可影响肠道微生物的组成和功能，从而影响机体酶的活性、数量和丰度；另一方面，肠道微生物及其分泌的酶类又能参与药物的代谢，从而影响其药效的发挥[16]。蔗糖是日常食品中的主要糖类，蔗糖酶可水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，蔗糖酶主要由小肠绒毛上皮细胞合成分泌，也可由肠道微生物产生[21]，小肠中的淀粉先经胰α-淀粉酶水解为麦芽糖，再被α-葡萄糖苷酶进一步水解成为葡萄糖[22]。淀粉酶和蛋白酶属于机体自身分泌，而纤维素酶属于肠道微生物分泌。与常规组比较，葛根素组小鼠蔗糖酶和淀粉酶活性显著升高，可能是机体对葛根素灌胃刺激的应激反应引起的。由肠道微生物活度数据可知，肠道微生物活度显著降低，与此同时，由肠道微生物分泌的纤维素酶活性亦显著降低，故推测葛根素能抑制肠道中表达纤维素酶的微生物的生长。

3.3 葛根素对小鼠体重的影响

以往研究表明，葛根素对不同类型肥胖均有一定程度的治疗作用，如Wang 等[23]、Scherer[24]发现葛根素能显著降低卵巢切除和胰岛素抵抗型肥胖大鼠的体重和体脂含量；张玉武等[25]用不同剂量的葛根素对膳食诱导的营养性肥胖大鼠灌胃6 周后，发现葛根素能显著降低肥胖大鼠的体重、血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和肥胖指数（Lee's）。该研究发现，小鼠摄入葛根素后体重增长率亦有所降低，这与以往研究结论一致。食物在小鼠体内代谢的途径和效率与消化酶的种类及其活性密切相关[26]，消化酶有助于膳食纤维和营养物质的消化吸收和胃排空，减少未消化食物进入肠腔内的比例，肠道消化酶活性的提高，可以预测消化率的提高[27]。因此，通过调节消化酶的活性促进机体代谢可能是葛根素控制体重的机制之一。

3.4 不足与改进

该研究中小鼠微生物活度变化数据代表的是肠道微生物变化的总体趋势。而肠道微生物群是一个复杂的系统，存在着数量众多的细菌和真菌，且可体外培养的微生物只占肠道微生物的小部分，故还需进一步利用高通量测序及酶技术研究葛根素对小鼠肠道微生态的影响，以作综合分析。