基于线粒体ND2 与ND4 基因探讨4 种绵羊的系统发生关系

胡 峻，陈天莹，李孟纯，段嘉宝，李 铀,2，杨具田

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730100；2.西北民族大学生物医学研究中心，甘肃省动物细胞技术创新中心，生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

中国固有的绵羊品种大致分为3 类，即蒙古羊系统、哈萨克羊系统和藏羊系统，其中以蒙古羊系统为主；而因各地区的地域差异，又可将中国绵羊分布划分为多个区域，由沿海区的寒羊、湖羊，到云贵高原区的小尾寒羊，再到北疆区的哈萨克羊、当巴什羊[1-2]。地方品种绵羊的种质资源对中国畜牧业发展以及绵羊育种有着十分重要的价值，但在现实生产中，为了获取更高的经济效益，牧民们常常通过杂交的手段来改良地方品种，从而使得生产性能相对较低的古老地方品种日趋减少甚至濒临灭绝，进而引发世界性的畜禽品种资源危机。因此，绵羊种质资源的保护意义重大且迫在眉睫[3]。

甘肃省的绵羊品种主要有甘肃高山细毛羊、兰州大尾羊、滩羊和藏羊等[4]。而兰州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）更是我国特有的地方品种之一，主要分布在甘肃中部的干旱地区，具有成熟早、繁殖力高等特点，适合在兰州地区饲养[5]。近年来，由于对地方特有品种的认识不充分，对其保护力度不够；加上外来品种引进的影响，甘肃省各个绵羊品种均存在不同程度的灭绝危机。据研究，兰州大尾羊灭绝频率为0.77，居北方11 个绵羊品种之首，品种贡献率为10.52%，居于第三，保护潜力为0.141 9，居第1 位，现已被国家列为濒临灭绝的遗传资源[6]。

线粒体DNA（mtDNA）是动物核外遗传的主要遗传物质，也是研究动物起源进化及群体遗传分化的理想对象[7]；在世代间没有基因重组，为严格母系遗传，同时还具有高突变率等特点，突变速率为单拷贝核DNA 的5～10 倍。因此，线粒体DNA 被广泛用于动物起源进化、物种鉴定、疾病诊断、衰老及动物经济性状的核外基因效应等研究[8]。已有许多学者对不同物种的mtDNA 进行了多方面的研究与探索[9]。

该研究对甘肃地区的兰州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）、滩羊（Tan sheep）、小尾羊（Small tailed han sheep）和藏羊（Tibetan sheep）的线粒体ND4和ND2基因进行扩增，利用生物信息学软件将扩增得到的序列与GenBank 上下载的其他绵羊品种的ND2和ND4基因序列进行比对，以探讨不同种群之间的系统发生关系，为研究甘肃地区绵羊品种的起源以及进一步利用和保护地方绵羊品种提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于甘肃当地羊场采集大尾羊（D1～D6）、滩羊（S1～S12）、小尾羊（X1～X9）和藏羊（T1～T10）的组织样本。

1.2 基因组扩增

1.2.1 引物设计 使用Gentra Puregene extraction kit（GentraSystems Inc.）从动物组织中提取纯度较高且分子量大的基因组DNA 用于后续试验。参照GenBank已发表的绵羊ND2与ND4基因序列设计引物，引物序列、退货温度与产物大小见表1，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 PCR 反应体系 上、下游引物浓度10 mmol/L，各0.5 μL；DNA 样品浓度50 ng/μL，2 μL；PremixTaq（Takara）浓度5 U/μL，12.5 μL；无菌水9.5 μL；最终得到25 μL 的PCR 反应体系。

1.2.3 PCR 反应条件 94℃预变性3 min；94℃变性45 s，54（58）℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环35 次；72℃延伸10 min。将扩增产物在1.4%的琼脂糖凝胶上电泳，采用凝胶成像仪检测。检测时着重观察PRC产物是否扩增成功以及是否有二聚体形成。

1.3 数据处理与分析

将成功扩增的PCR 产物送至兰州天启基因生物科技有限公司测序，反馈的测序结果使用Geneious 11.0.4 进行处理，拼接获得较为完整的序列波峰图，并进一步校对，获得单个样本的完整序列，导出Fasta格式的文件以进一步处理分析。使用MEGA-X 软件将所得全部ND2、ND4基因序列与Genbank 上已发表的其他20 个绵羊品种的ND2、ND4基因序列（表2）进行比对。

表2 Genbank 上已发表的其他绵羊物种信息

该研究以盘羊（Ovis ammon）作为进化树的外群，采用MEGA-X 软件分别用邻接法Neighbor-joining，NJ）构建NJ 树与最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建ML树。其中，邻接法构建的NJ树以p-distance法计算遗传距离，Bootstrap 重复选择为1 000 次；最大似然法构建的ML 树，以Find BestDNA/Protein Models （ML）中最低的BIC 分数的模型作为最佳模型，Bootstrap 重复选择也为1 000 次。

2 结果与分析

2.1 基因测序结果

测序结果显示，PCR 扩增所得ND2、ND4基因序列大小均为200 bp 左右，经Geneious11.0.4 校对，并与国内外ND2、ND4基因序列比对，确定样品中DN2基因序列为184 bp，ND4基因序列为235 bp。

利用MEGA-X 软件中的Statistic 功能分析表明：ND2基因中T、C、A、G 平均含量分别为25.2%、27.9%、38.1%、8.8%，A+T=63.3%、C+G=36.7%，含有保守位点177 个，变异位点7 个（颠换位点4 个、转换位点3 个），简约信息位点3 个，自裔位点4 个，颠换多在A-G 间发生，转换多在C-T 间发生；ND4基因中T、C、A、G 平均含量分别为28.8%、26.7%、29.8%、14.6%，A+T=58.6%、C+G=41.3%，含有保守位点230 个，变异位点6 个（均为颠换位点），简约信息位点4 个，自裔位点2 个，颠换均在A-G 间发生。DN2与ND4基因中G含量明显低于其他3种碱基，出现典型的反G 偏倚。

2.2 基于ND2 与ND4 基因的绵羊系统发育分析

利用MEGA-X 将拼接校对后的所有ND2、ND4基因与GenBank 上下载的20 个序列，使用邻近法和最大似然法构建系统发生树，结果如图1、图2 所示。

基于ND2、ND4基因所构建的ML 树与NJ 树结果略有差异，其原因可能是所研究的样本量较小且序列较短。其中ND2基因构建的ML 树（图1A）中，大部分滩羊样本与其他样本间的亲缘关系相距较远，故而单独聚为1 小支，这样的情况在其他3 种羊中也有体现，但存在个别不同品种样本间亲缘关系较近的情况；而NJ 树（图1B）所示结果中，哈姆达尼羊、乌拉藏羊、叶城羊等与部分大尾羊、藏羊、小尾羊样本聚为1支；而萨赫勒羊、贾伦克羊等与另一部分藏羊、小尾羊以及个别大尾羊样本、大部分滩羊样本聚为1支；除去上述2 大支之外，X1、T9、S5 这3 个样本之间亲缘关系更为接近，故而单独聚为1 小支，这样的情况在基于ND4基因构建的NJ 树中也存在，但有所不同的是在基于ND4基因的NJ 树中，T9、S1、S5、X1 这4 个样本单独聚为1 小支，其余样本则分为2 支。基于ND4基因构建的ML 树（图2A）中所有样本大致分为2 支，而T9、S5、S2、S1、X1 聚为1 小支，其余样本聚为1 支，从中可以推断T9、S5、S2、S1、X1 样本可能存在基因流故而亲缘关系较近；而基于ND4基因的NJ 树（图2B）中，样本在分为2大支的同时，还包含有2 个小分支，分支中个样本的亲缘关系情况与ND2基因构建的NJ 树中大致相似。

图1 基于ND2 基因构建系统发生树

图2 基于ND4 基因构建系统发生树

3 结论与讨论

近年来，线粒体DNA（mtDNA）已经成为分子遗传学的热点之一。动物线粒体基因组的13 个蛋白基因包括细胞色素b 基因（Cytb）、细胞色素氧化酶3 个亚基基因 （COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）、NADH氧化还原酶7 个亚基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）和ATP 酶2 个亚基基因 （ATPase6，ATPase8），这13 个蛋白或亚基都是线粒体内膜呼吸链的组分[10-11]。这些蛋白基因组的研究在探讨品种起源及分化、种间的系统演化、种内母系演化、地方品种资源与地理分布的关系等方面有广泛应用。

该研究选取NADH 氧化还原酶7 个亚基基因中的ND2和ND4基因进行扩增，探讨甘肃地区4 种绵羊与国内外其他品种的亲缘关系，通过反复试验确定最佳的PCR 反应条件，再利用生物信息学软件对测序数据进行分析，最后构建进化树。

试验结果表明，甘肃地区4 种绵羊与国内外绵羊均有不同程度的亲缘关系，在NJ 树中所有样本（除外群）聚为1 大支，进而再分为2 小支，其中2 小支中大尾羊、滩羊、小尾羊和藏羊样本均有分布，而在ML 树中所有样本（除外群）均聚为1 支且并无分支，说明试验所选4 种绵羊与这20 个绵羊品种有较近的亲缘关系，也说明所采集到绵羊样本有可能与这20 个亲缘关系较近的品种存在基因流。传统观点则认为小种群内的过度基因交流会造成金角衰退、遗传多样性的丧失以及种群数量的减少，而不同物种种群间的基因交流则可以丰富自然界生物多样性的程度[11]。甘肃地区绵羊品种基因流存在的主要原因可能是从20世纪就开始进行的世界范围内的绵羊品种杂交，随着社会的发展与生活水平的提升，农牧民已经不满足于当地绵羊品种的单一优势性状，开始从国内外不同地区引入各种优质绵羊种质资源与当地特有的绵羊品种进行杂交并培养出具有更高经济价值的新品种，但由于长期进行杂交，新的经济价值高的品种不断形成导致世界各国生产性能低的古老地方品种趋于减少，濒临灭绝，从而引发世界性的畜禽品种资源危机。