杉木叶挥发性成分的GC-MS指纹图谱构建

王 琪 于晓锐 刘 云 杨晓琴 李丽萍 王军民 赵 平,

（1. 西南林业大学西南地区林业生物质资源高效利用国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650233；2. 西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650233）

杉木（Cunninghamia laneolata）为杉科（Taxodiaceae）杉木属（Cunninghamia）乔木，是我国长江流域、秦岭以南地区栽培最广、生长快、经济价值高的用材树种[1]，对杉木的研究多集中在生物学、生理学、生态学、化学成分以及木材应用等方面[2-10]。杉木叶为条状披针形，气微香，味涩，具有祛风、化瘀、活血、解毒等功效[11]，在民间常用于治疗半身不遂初起、风疹、咳嗽、牙痛、疱疮、跌打损伤和毒虫咬伤等[12-13]。已报道的杉木叶化学成分主要包括双黄酮类[14-15]、半日花烷型二萜类[16-17]和挥发油类[18-20]等，具有抗炎、镇痛和抗菌等生物活性[21-22]。高雪芹等[18]发现安徽产杉木叶醇提物的石油醚溶解组分中的主要挥发性成分为十八酸-1,3-甘油二酯、二十七烷、棕榈酸-2-(十八烷氧基)乙酯、油酸和三十七醇等，Hsu等[19]发现台湾省产杉木叶挥发油中的主要成分为弥罗松酚、τ-杜松醇和α-杜松醇等。于晓锐等[20]发现浙江省产杉木叶的主要挥发性成分为α-蒎烯、β-月桂烯、β-石竹烯、d-柠檬烯、β-榄香烯和β-可巴烯等，且不同无性系杉木叶在挥发油的提取率、化学成分组成和含量上均存在一定差异。迄今为止，有关不同产地杉木叶挥发性成分的差异性分析比较则鲜有报道。

指纹图谱是指在一定的实验条件下将待测物经适当处理后得到的能够标示其化学特征的谱图，具有整体性和可量化的特点，已被广泛应用于中药质量控制、食品评价、种子检测和溯源鉴定等领域[23-25]。其中，GC-MS指纹图谱检测技术是国际上公认的控制物质品质的最有效的手段之一[26]。杨俊杰等[27]通过GC-MS分析水杉（Metasequoia glyptostroboides）种子挥发油的主要化学成分，并建立了由8个共有成分构成的指纹图谱，能够较好反映产地差异情况。本研究以9个不同产地的37批杉木叶为原料，采用同时蒸馏-萃取法结合GC-MS联用技术构建杉木叶挥发性成分指纹图谱，并结合相似度评价（夹角余弦法）及化学模式识别（主成分分析和聚类分析）对杉木叶挥发性成分进行综合评价，以期为杉木叶的快速溯源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

采集了杉科杉木属植物杉木叶样品共计37批次，经阴干、粉碎，过3号筛处理后备用。各批次样品的编号、采集时间和地点见表1，其中S1～S20为4种无性系杉木。无水乙醇、乙醚、正己烷均为分析纯（购自广东光华科技股份有限公司），超纯水。

表 1 杉木叶样品的来源Table 1 Sources of C. laneolata leaves samples

1.2 仪器与设备

890B-5977气相色谱-质谱联用仪（Agilent公司，美国）；HP-5MS石英毛细管柱（30 μm×250 μm×0.25 μm，Agilent公司，美国）；中药粉碎机（浙江瑞安永历制药机械有限公司，中国）；BSA224S电子天平（精确到0.000 1 g，北京赛多利斯科学仪器有限公司，中国）。

1.3 试验方法

1.3.1样品处理

采用同时蒸馏-萃取法[23]，分别称取37批杉木叶粉末各20.00 g，置于同时蒸馏-萃取装置中静置浸泡60 min，提取180 min，收集正己烷萃取溶液，减压浓缩干燥后称量，取各萃取物样品用正己烷溶解，0.45 μm滤头过滤后供后续分析用。

1.3.2GC-MS分析条件

色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 mm ×250 mm × 0.25 μm）；进样口温度250 ℃；进样形式：不分流进样；进样量1.0 μL；载气为高纯氦气，恒流，柱流速1.0 mL/min；柱温的起始温度为50 ℃（保留2 min），以5 ℃/min升至220 ℃（保留10 min），运行时间46 min。

质谱条件：离子源为EI，离子化电压70 V，检测器电压0.9 kV，发射电流60 A，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃；扫描范围15～500 amu，溶剂延迟4 min。

1.3.3方法学考察

1）空白试验：正己烷作为空白溶液，进样量1 μL，观察溶剂正己烷出峰的情况，以及对杉木叶供试样品的共有峰影响状况。

2）精密度试验：取同一杉木叶供试样连续进样5次，计算各共有峰保留时间和峰面积的相对标准差（RSD）。

3）重现性试验：取同一杉木叶样品，平行准备3份供试样，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD。

4）稳定性试验：取同一杉木叶供试样，分别于0、4、8、12、24 h进样，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD。

5）质控样本制备方法：质控样品由所有检测样品混合而成，在样本上机分析过程中，当改变分析样品产地时或达到5个样本量时，插入1个质控样品进样。

1.4 数据处理

采用NIST MS数据库对匹配度达到90%及以上的挥发性成分进行谱库检索并结合文献进行定性分析，使用峰面积归一化法计算各挥发性成分的相对含量。采用Origin Pro 8.1软件建立GC-MS指纹图谱，采用IBM SPSS Statistic 23.0软件进行相似度分析、主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

空白试验中，在检测时间内正己烷溶剂的响应值与供试样品共有峰不在同一数量级，对样品的检测基本无影响，说明正己烷作为样品溶剂的可行性。供试样品溶液各共有峰的相对保留时间的RSD=0.783 4%，共有峰相对峰面积比值的RSD=3.491 6%，两者的RSD值均<5%，且在检测时间内连续未间断出峰，峰形的分离度高，证明该方法分离效率高、可重复性好、样品及测试仪器运行稳定，符合指纹图谱的检测要求，可用于构建杉木叶指纹图谱。

2.2 杉木叶中挥发性成分的分析与鉴定

对37批杉木叶样品进行GC-MS分析，共鉴定出140种挥发性成分，主要为烃类、醇类、酮类和其他类等（图1）。其中，从浙江开化、贵州七星关、云南马关、云南盈江、云南梁河、贵州大方、湖南湘潭、湖北麻城、福建南平杉木叶和混合样品中分别鉴定出116种、76种、64种、84种、53种、62种、58种、57种、85种和69种。从采样地点看，福建南平杉木叶中烃类的相对含量最高（19.93%），湖南湘潭样品中醇类的相对含量最高（5.30%），浙江开化样品中酮类的相对含量最高（2.93%），其他类别挥发性成分在贵州大方样品中的相对含量最高（5.18%）。杉木叶中相对含量较高的挥发性成分主要有β-桉叶烯、α-蒎烯、氧化石竹烯、β-榄香烯、环封莰烯和3-蒈烯等。

图 1 不同采集地杉木叶挥发性成分的相对含量和种类Fig. 1 Relative contents and classification of volatile components in C. lanceolata leaves from different areas

2.3 指纹图谱的构建

建立指纹图谱的关键在于找到稳定的特征峰和参照峰，特征峰根据色谱图和色谱峰的保留时间确定，参照峰一般选取峰面积较大且相对稳定的峰[28]。通过比较37批杉木叶的保留时间，发现在4.0～46.0 min内有30个共有峰，可作为杉木叶指纹图谱稳定的特征峰。比较30个特征峰，发现保留时间为7.37 min的峰相对稳定且峰面积最大，可设为参照峰。将参照峰的保留时间和峰面积皆定为1，分别计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积，以混合样品的均值作为标准图谱数据，结果见表2。

将37批杉木叶样品的离子色谱图原始数据导入Origin Pro 8.1软件后建立的杉木叶挥发性成分GC-MS指纹图谱，如图2所示。37批杉木叶样品在整体上有较高的相似性，出峰分离度较好且出峰完全，从相对峰面积数据可以看出，不同产地的杉木叶，甚至相同产地的无性系杉木叶存在较大的差异。

2.4 相似度分析

夹角余弦值法分析是一种新型的指纹图谱技术质量评价方法，将色谱指纹图谱看作多维空间内的向量，利用简单的数学公式计算指纹图谱间的相似度[29]。以37批杉木叶样本的相对峰面积归一化数据为依据，采用计算向量夹角余弦值的方法进行相似度分析，所得结果（表3）显示，样本的相似度基本上均达到0.8，证明相似度水平较高。但样本S24所得夹角余弦值小于0.8，在保留时间为4.32、8.58、20.23～24.40、26.95 min的6个峰的相对峰面积数据均比参照峰峰面积大，说明出峰情况与其他批次样品有较大区别。

2.5 化学模式识别

2.5.1主成分分析

主成分分析是一种能够将多个变量通过线性变换选出较少个数重要变量的一种多元统计方法[30]。将37批杉木叶样品共有峰的峰面积数据导入IBM SPSS Statistic 23.0软件中，选择分析-降维-因子分析，得到前3个主成分的特征值分别为28.773、4.511和2.058（均大于1），方差累计贡献率达95.519%，超过80%，说明前3个主成分综合了37批杉木叶样品挥发性成分的绝大部分原始变量信息，能代表样品挥发性成分的主要特征（表4）。从主成分分析得分图（图3）可知，样品S2、S25、S28、S29、S30的主成分较为相近聚为1类；S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S16、S17、S18、S19、S20、S26的主成分相较于其他样品较为相近，聚为第2类；S11、S12、S13、S14、S15、S21、S22、S23、S27、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37则聚为第3类，不同样品的挥发性成分之间存在差异。由图3可知，杉木叶样本与质控样本聚合度较高，表明检测条件稳定，重复性好。主成分分析可将杉木叶进行有效的区分，该结果与相似度评价的结果相一致。

图 3 杉木叶样品挥发性成分的得分图Fig. 3 Score plots of on C. lanceolata leaves volatile components

表 3 37批样品的向量夹角余弦值Table 3 The vector angle cosine of 37 groups of samples

表 4 主成分总方差解释Table 4 Total variance explained

图 2 杉木叶挥发性成分的GC-MS指纹图谱Fig. 2 GC-MS fingerprinting of volatile components in C. lanceolata leaves

表 2 37 批杉木叶挥发性成分的相对峰面积Table 2 Relative peak area of volatile components of 37 C. lanceolata leaves

2.5.2聚类分析

聚类分析是一种常用的指纹图谱技术质量评价方法，针对没有样本所属类别信息的物质，以分类图的形式进行直观地系统分析，可对大批量样品进行快速分类或身份识别[31]。将37批杉木叶共有峰的峰面积数据进行聚类分析，结果见图4。S2、S25、S28、S29、S30聚为1类，S1、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S16、S17、S18、S20、S26聚为第2类，S11、S12、S13、S14、S15、S19、S21、S22、S23、S27、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37聚为第3类，该结果与相似度评价及主成分分析结果一致。这3类都是以最小距离形成了聚类，表示它们之间的相似度最大。从整体上看，不存在较大差异的样品，在指纹信息提取方面，37批样品挥发性分析结果均不会对指纹图谱的构建造成较大影响，这也印证了样品的同源性。

图 4 杉木叶挥发性成分聚类树状图Fig. 4 Cluster pedigree diagram of volatiles fromC. lanceolata leaves

3 结论

本研究对所建立的杉木叶挥发性成分GC-MS方法进行了方法学考察，该方法精密度高，稳定性和重现性好。并对9个不同产地37批杉木叶挥发性成分进行分析，共鉴定出140种挥发性成分，其成分类型主要有烃类、醇类、酮类，相对含量较高的成分有β-桉叶烯、α-蒎烯、氧化石竹烯、β-榄香烯、环封莰烯和3-蒈烯等。比较了37批杉木叶样品的色谱图，结合夹角余弦法进行分析，确定相对含量稳定的30个峰为其特征值指纹峰，建立了杉木叶挥发性成分的GC-MS指纹图谱。主成分分析结果发现不同产地杉木叶挥发性成分存在较大差异，并通过聚类分析能够快速鉴定其产地来源。此外，同一产地不同品系挥发性成分亦略有不同，这一结果与于晓锐等[20]的报道较为相似。从生长环境上看，浙江开化属于丘陵地带，云南马关、盈江及梁河属于山地高原，贵州七星关、大方、湖南湘潭、湖北麻城以及福建南平均属于山地、高原向丘陵的过渡地带，与主成分分析和聚类分析中分成的3类也基本吻合。本研究通过GC-MS指纹图谱结合相似度评价和化学模式识别能够明确不同区域杉木叶挥发性成分的差异，为杉木叶的快速溯源提供了技术支撑。