CACNA1H基因敲除对小鼠孤独症样行为及海马神经元形态学的影响

焦 翠，王俭妹，况海霞，武志红△，柳 涛,2△

(南昌大学第一附属医院 1. 儿科，2. 医学科研中心，南昌 330006)

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一种较常见的影响患者一生的神经系统发育障碍性疾病，核心症状是社交沟通和互动不足，重复刻板行为和/或兴趣狭窄。ASD在全球范围内普遍流行且发病率逐年上升，美国疾病预防控制中心的数据显示其患病率约为1/59[1]，已成为全球性的难题之一。目前，ASD的发病机制尚未完全清楚，因此缺乏特效治疗且预后差，多需终生照顾，对患者家庭及社会带来沉重的精神及经济负担。

ASD的发病机制涉及遗传、免疫、环境及神经生物学等多个方面，其中遗传因素被认为是最主要的[2]。约30%的ASD病例被发现与基因的新发突变有关，已知与ASD高度相关的基因有53种，如GIGYF1、KDM6B和PTEN等[3]。CACNA1H基因位于16p13.3，其编码的T型钙通道3.2亚型(Cav3.2)对神经兴奋性、信息传递、细胞增殖分化和神经发生等的调控极为重要[4-5]，该基因突变可影响Cav3.2功能，导致原发性癫痫[6]、ASD[7]和精神分裂症[4]等神经精神性疾病的发生。2006年，美国哈佛大学的一项研究对461例ASD患者进行了CACNA1H基因组靶向测序，发现4个位点存在错义突变[7]。2019年的一项研究亦报道了1例CACNA1H基因突变的患者存在ASD和全面发育障碍[8]。既往研究结果虽已提示CACNA1H与ASD存在一定的相关性，但缺乏生物学证据和动物模型的验证。

树突棘是神经元间行使功能和信息传递的关键部位，树突棘的形态异常在ASD病理过程中扮演着重要角色，因此，本研究利用CACNA1H基因敲除(knockout, KO)小鼠(CACNA1H-/-)及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记脑神经元的Thy1-GFP-O小鼠，通过多种行为学和神经形态学相结合的方法，研究CACNA1H缺失对小鼠ASD样行为及海马神经元形态学的影响，以期为ASD临床治疗和药物开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级3～4周龄的CACNA1HKO小鼠(C57BL/6，亲代购于美国Jackson公司)25只(实验组)，野生型(wild type，WT)小鼠(C57BL/6，亲代购于上海南模生物公司)26只(对照组)，雌雄不限(雌 ∶雄≈1 ∶1)，KO小鼠在本课题组已发表的研究中多次应用[9]。SPF级Thy1-GFP-O转基因小鼠系南昌大学生命科学院梅林教授实验室赠送。动物房维持12 h/12 h昼夜循环(7:00～19:00)，室温23～25 ℃，湿度50%，小鼠自由获取食物和饮水。实验动物操作严格遵守《南昌大学实验动物管理办法》，本研究通过南昌大学实验动物伦理审查(2017009)。

1.2 动物行为学测试

1.2.1三箱实验 是反映动物社交行为的经典实验[10]，可测试小鼠本能的社交互动及对新社交对象识别的能力。箱体大小为60 cm×40 cm×25 cm，中间由两块隔板将其均分成三格。两隔板上各开一个6 cm×6 cm的门，任小鼠自由进出。左右箱中各放入一个金属笼，用于放置陌生小鼠。测试方法参照文献[11]：摄像头置于盒子正上方，测试由适应阶段、社交互动阶段和对新社交对象的识别阶段组成，每阶段为10 min，均安排在上午(8:00～12:00)进行，每次测试前均预先适应30 min(以下同)。实验鼠在箱内自由适应10 min后，在一侧金属笼中放入一只同性别且对于实验鼠是陌生的小鼠(stranger 1，S1)，另一侧金属笼不放任何物品(object，O)，观察10 min，随后在另一侧金属笼中放入一只同性别的、新的陌生小鼠(stranger 2，S2)，之前的S1不取出，继续观察10 min。每组测试结束后，用酒精擦洗盒子后再进行下一只实验鼠的检测(下同)。对照组取9只、实验组取7只小鼠进行该实验。探索偏好指数的计算：IndexS1-O=(S1-O)/(S1+O)；IndexS2-S1=(S2-S1)/(S2+S1)。

1.2.2旷场实验 用于观察实验动物的焦虑情绪和重复刻板行为[12]。开阔旷场大小为50 cm×50 cm×25 cm，设定中心区域至边缘为10 cm，摄像头位于盒子正上方。测试时将实验鼠放在旷场中央，任其自由活动20 min。对照组取17只、实验组取18只小鼠进行该实验[因部分小鼠未记录到20 min，自梳理行为(小鼠两个前肢抚摸或刮擦面部、头部或身体以及舔身体的行为)仅分析对照组15只、实验组12只]。观察指标为小鼠前10 min内在旷场中心活动的时间、10～20 min内自梳理行为的时间，以上两种行为学检测项目间隔1～2天进行。

1.3 体质量、脑质量及脑体积测量

行为学实验后，选取两组中同窝出生的小鼠，称取其体质量，予腹腔注射乌拉坦(1.2 g/kg)麻醉，用30 mL、4 ℃生理盐水心脏灌流，断头取脑。滤纸上吸干后天平称取脑组织质量，然后放入装有4 ℃生理盐水的小量筒中，以液面刻度变化反映脑体积大小。

1.4 神经元数目观察

将上述脑组织放入10%(体积分数)中性甲醛溶液中固定并脱水后进行石蜡包埋，制备3 μm冠状切片(前囟-1.64～-2.12 mm)。采用尼氏染色(Nissl staining，A、B液购于北京Solarbio公司)，染色时将切片浸入装有cresyl violet stain试剂(A液)的染缸中，56 ℃温箱浸染1 h，然后用去离子水冲洗数次，随后置于Nissl differentiation液(B液)中分化数秒至2 min(背景接近于无色)，最后无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。对照组取8只、实验组取6只小鼠的脑组织标本，从每个标本中随机选取≥3张切片于图像导航扫描仪(购于日本Olympus公司)40倍镜下观察，计数海马CA1～CA4区及齿状回区神经元数目，结果以神经元相对数量(与WT均值相比)表示。

1.5 海马神经元树突棘观察

1.5.1构建实验组和对照组小鼠 将成年CACNA1H杂合子小鼠与Thy1-GFP-O小鼠杂交2代以上，将获得的子代基因型为CACNA1H-/--Thy1+(KO-GFP)的小鼠设为实验组，将CACNA1H+/+-Thy1+(WT-GFP)小鼠设为对照组，每组各5只。

1.5.2海马神经元树突棘密度及成熟度观察 将KO-GFP和WT-GFP小鼠麻醉后以30 mL生理盐水和30 mL 4%(体积分数)多聚甲醛心脏灌流，取脑组织置入4%多聚甲醛中固定6 h。在振动切片机(VT1000S，购于德国Leica 公司)上制备325 μm脑冠状切片。切片经4%多聚甲醛固定2 h后，PBS洗3次，每次10 min。用抗荧光衰减封片剂(购于北京Solarbio公司)封片。应用共聚焦显微镜(购于德国Zeiss公司)拍摄63×Zoom1.5 Z-stack叠加下海马齿状回区神经元的二级树突，树突棘密度以每10 μm的树突棘数目表示。平均每只小鼠纳入计数的神经元≥8个，每个神经元随机选取一段长20～50 μm的树突进行分析。成熟度为每段树突上成熟型树突棘个数与总树突棘的比值。

1.6 统计学分析

行为学视频采集软件为Logitech Webcam，分析软件为MATLAB R2016b(MathWorks)，尼氏染色结果分析软件为Image-Pro Plus 6.0，树突棘结果分析软件为ZEN 2010及ImageJ，数据统计软件为SPSS 17.0，作图软件采用GraphPad Prism 7.0和Adobe Illustrator CS5。数据均以均数±标准误(standard error, SE)表示，小鼠在三箱实验中不同箱中的时间比较采用Two-way方差分析，采用Tukey事后检验进行两两比较，其余实验均采用双侧独立样本t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CACNA1H KO小鼠社交行为学特点

如图1和表1所示，在社交互动阶段中，WT与KO小鼠在S1箱中的活动时间均比在O箱中长(Two-way ANOVA：F1,14=95.086，P<0.05；Tukey’s Post-Hoc test：PWT<0.05，PKO<0.05)，WT和KO小鼠对S1探索的偏好指数差异无统计学意义(t=1.044，P>0.05)。在对新社交对象的识别阶段中，WT小鼠在S2箱中的活动时间比在S1箱中长，KO小鼠在S2和S1箱中的停留时间差异无统计学意义(Two-way ANOVA：F1,14=18.062，P<0.05；Tukey’s Post-Hoc test：PWT<0.05，PKO>0.05)，且此阶段KO小鼠对S2探索的偏好指数显著低于WT小鼠(t=2.390，P<0.05)。

2.2 CACNA1H KO小鼠焦虑情绪及重复刻板行为学特点

旷场实验结果显示，与WT小鼠相比，KO小鼠在中心区域活动的时间更少(t=2.503，P<0.05，图2A、B，表2)，且在旷场中自梳理时间更长(t=-2.299，P<0.05，图2C，表2)。

2.3 CACNA1H KO小鼠体质量、脑质量与体质量比、脑体积及海马神经元计数

如图3A～D及表3所示，与WT小鼠相比，KO小鼠体质量(t=-0.274，P>0.05)、脑质量与体质量比(t=0.356，P>0.05)以及脑体积(t=-0.660，P>0.05)的差异均无统计学意义。

A and D, representative heat maps of mice movements in the sociability test session and the social novelty recognition test session in the three-chamber test, respectively; B and E, averaged time (s) spend in each chamber of WT (n=9) and KO (n=7) mice; C and F, averaged preference index from exploration time of WT (n=9) and KO (n=7) mice. KO, knockout; WT, wild type; O, object; S1, stranger 1; S2, stranger 2； M, middle. * P<0.05.图1 CACNA1H基因敲除对小鼠社交行为的影响Figure 1 Effects of CACNA1H gene knockout on social behavior in mice

表1 WT与KO小鼠的三箱实验结果Table 1 Results of three-chamber test of WT and KO mice

A, representative track and heat maps of mice movements in the open field test; B, the time spend in the center was decreased in KO mice (n=18) compared to that of the WT mice (n=17); C, the grooming time was significantly increased in KO mice (n=12) compared to that of the WT mice (n=15). Abbreviations as in Figure 1. * P<0.05.图2 CACNA1H基因敲除对小鼠焦虑及自梳理行为的影响Figure 2 Effects of CACNA1H gene knockout on anxiety and self-grooming behavior in mice

表2 WT与KO小鼠的旷场实验结果Table 2 Results of open field test of WT and KO mice

表3 WT与KO小鼠体质量、脑质量/体质量和脑体积测量Table 3 Body weight, brain weight/body weight, and brain size of WT and KO mice

尼氏染色计数结果表明，敲除CACNA1H可导致小鼠海马齿状回区神经元数目显著减少(t=2.323，P<0.05)，CA1～CA4区细胞数目差异无统计学意义(CA1：t=0.555，P>0.05；CA2：t=1.437，P>0.05；CA3：t=1.176，P>0.05；CA4：t=1.669，P>0.05)，见图3E、F及表4。

2.4 CACNA1H KO小鼠齿状回区树突棘的变化

树突棘通常分为伪足型、细长型、分叉型、蘑菇型和短粗型，前两种为未成熟型，后三者为成熟型[13](图4A)。两组小鼠齿状回区神经元的树突棘密度和成熟度的变化相比较(图4B)，KO-GFP小鼠的树突棘数目高于WT-GFP小鼠[(10.03±0.69)/(10 μm)vs.(8.32±0.20)/(10 μm),t=-2.374，P<0.05，图4C]；两组小鼠树突棘成熟度比例(WT-GFP：34.40%±1.03%；KO-GFP：39.60%±2.48%)差异无统计学意义(t=-1.935，P>0.05，图4D)。

表4 WT与KO小鼠海马区尼氏染色神经元相对数Table 4 Relative number of neurons in the hippocampus of WT and KO mice counted by Nissl staining

3 讨论

电压门控钙通道(voltage-gated calcium channel, VGCC)对调控细胞内和细胞间的信号传导，如基因表达、激素和神经递质释放等过程具有重要作用[4]。目前包括CACNA1H基因在内的所有编码VGCC的基因均被发现是ASD的风险基因，其中部分VGCC亚型突变的动物模型已证实具有ASD表型，如Bader等[14]观察到TS2-neo(Cav1.2编码基因CACNA1C突变)小鼠具有明显的社交功能受损、重复刻板行为、焦虑及记忆受损等ASD样行为改变。人类基因组测序结果揭示，CACNA1H是ASD的风险基因，且电生理实验已证实体外培养的CACNA1H突变细胞的Cav3.2电流密度降低、电压依赖性门控特性改变，从而导致神经元兴奋性降低[7-8,15-18]，表明ASD可能与CACNA1H突变导致Cav3.2功能低下有关。本研究在动物模型中发现幼年CACNA1HKO小鼠具有ASD的核心症状，可能与其海马齿状回区神经元数目减少及树突棘密度增加有关。

以往研究表明，CACNA1HKO小鼠具有异常的神经行为表型。Gangarossa等[19]的研究显示，8～12周龄CACNA1HKO小鼠的自发运动功能与WT小鼠无显著不同，但KO小鼠在旷场中心运动的时间显著低于同龄WT小鼠，这表明与WT小鼠相比，KO小鼠更焦虑。本研究使用3～4周龄不限雌雄的CACNA1HKO小鼠，旷场实验结果与Gangarossa等[19]的研究一致，表明敲除CACNA1H后，无论是幼年还是成年时期，与WT小鼠相比，KO小鼠均存在焦虑倾向，但具体所涉及的脑区及发病机制尚不清楚。促肾上腺皮质激素释放因子受体1可在功能上特异性与哺乳动物Cav3.2耦联，激活该受体可抑制Cav3.2而导致焦虑的发生[20]，这可能是CACNA1HKO小鼠具有焦虑倾向的机制之一。Henbid等[21]给具有CACNA1H错义突变的遗传缺失型癫痫大鼠腹腔注射Cav3拮抗剂(Z944)，发现该药可逆转其社交缺陷，表明Cav3.2有可能成为改善ASD患者社交障碍的治疗新靶点。

A, representative brain morphology of WT and KO mice; B, the body weight of WT (n=9) and KO (n=7) mice; C, the ratio between body weight and brain weight of WT (n=9) and KO (n=7) mice; D, the brain size of WT (n=9) and KO (n=7) mice; E, representative Nissl staining figures of hippocampal sections from WT and KO mice (the white squares represent the areas for analysis); F, relative number of neurons in each subregion of the hippocampus in WT (n=8) and KO (n=6) mice, the number in the histogram represents the number of slices. DG, dentate gyrus; other abbreviations as in Figure 1. * P<0.05.图3 CACNA1H基因敲除对小鼠大脑形态及海马神经元数目的影响Figure 3 Effects of CACNA1H gene knockout on brain morphology and the number of neurons of the hippocampus in mice

A, classification of dendritic spines; B, photomicrographs showing representation of dendritic spines in hippocampal dentate gyrus neurons of WT-GFP and KO-GFP mice; C, CACNA1H gene knockout significantly increased the density of dendritic spines in KO mice (WT-GFP n=5, KO-GFP n=5); D, percentage of mature spines in WT-GFP (n=5) and KO-GFP (n=5) mice. The number in the histogram represents the number of segments of dendrite. GFP, green fluorescent protein; other abbreviations as in Figure 1. * P<0.05.图4 CACNA1H基因敲除对小鼠树突棘的影响Figure 4 Effects of CACNA1H gene knockout on dendritic spines in mice

此外，CACNA1HKO小鼠的识别记忆功能也是受损的[19,22]。焦虑与记忆功能受损与ASD有一定关系，但并非其核心症状。社交异常和重复刻板行为是ASD的核心症状，在动物模型中主要由三箱实验和自梳理行为来评估。本研究的三箱实验结果显示，KO小鼠与WT小鼠对陌生同类S1的探索兴趣均明显多于无生命物体O，但KO小鼠对新的社会刺激S2的探索兴趣明显低于对已接触过的社会刺激S1，证明KO小鼠的社交行为存在缺陷。此外，本研究发现KO小鼠的自梳理时间比WT小鼠显著增多，提示KO小鼠具有显著的重复刻板动作。与此结果不同，Gangarossa等[19]在大理石埋藏实验中并未发现Cav3.2 KO小鼠存在重复或强迫行为，可能与实验动物的年龄不同有关。目前，CACNA1H敲除导致小鼠出现ASD样表型的具体机制不明，有待进一步研究。

以往研究表明，ASD患者大脑质量、体积、神经元数目与正常对照组相比均有显著差异[23-24]，但本研究中，与WT小鼠相比，KO小鼠的体质量、脑质量和脑体积差异均无统计学意义，表明敲除CACNA1H对幼年期小鼠脑的大体结构无显著影响。小鼠行为异常往往是神经元回路失调和突触功能障碍导致的[10]。与ASD发病有关的脑区包括海马、额叶皮质和杏仁核等。有研究显示，CACNA1H突变可影响正常的神经元功能，特别是神经发生的过程[25]。例如，Cav3.2可通过激活Caspase-3调节早期胚胎脑发育过程中的神经祖细胞的分化[5]。在ASD中已被证实存在海马齿状回形成缺陷以及神经发生失调[26-27]。由于Cav3.2在海马齿状回区中大量表达[28]，因此敲除CACNA1H极有可能影响齿状回区神经元的发生。本研究证实KO小鼠海马齿状回区的神经元数目明显少于WT小鼠。

树突棘是信号传入的主要神经元结构，其数量、大小和形态是决定突触传递强度和稳定性的关键因素[29]，树突棘数目和形态的改变是ASD的重要发病机制之一[30]。Cav3.2在树突和树突棘大量分布[31]，说明其与树突结构和功能密切相关。以往研究发现，无论是ASD患者还是ASD模型动物均出现大脑树突棘密度增加，细长型/短粗型比例降低，即不成熟型居多的现象[29]。2018年，Huang等[32]采用高尔基染色(Golgi staining)方法发现了成年CACNA1HKO小鼠海马CA1区树突棘密度比WT小鼠少。Thy1-GFP-O小鼠的皮层和海马区域有10%～20%的兴奋性神经元高表达绿色荧光蛋白，是被广泛应用于树突棘形态分析的小鼠动物模型。本研究证实幼年KO小鼠海马齿状回区树突棘密度增加，这一现象与Huang等[32]的研究不同，可能与小鼠的年龄、研究的脑区域及研究方法不同有关，但与ASD患者大脑树突棘改变类似[29]。因在尼氏染色中发现KO小鼠海马齿状回区神经元数目明显少于WT小鼠，本研究重点观察了齿状回区神经元的树突棘变化，其他区域的树突棘是否有类似变化还有待进一步研究。此外，本研究发现KO-GFP小鼠齿状回区成熟与不成熟树突棘的比例无显著变化，表明树突棘数目的变化可能是导致KO小鼠ASD样表型的主要机制。兴奋性突触功能障碍是ASD的重要发病机制之一，今后我们将进一步对CACNA1HKO小鼠海马等区域神经元进行电生理记录，观察其树突棘密度改变是否导致神经元兴奋/抑制失衡等变化。

综上所述，本研究观察了幼年CACNA1HKO小鼠神经行为学、海马齿状回区神经元及树突棘的改变，在动物模型中证实了CACNA1H基因缺失与ASD的相关性，为后期进一步探讨CACNA1H基因缺失导致ASD样表现的分子和细胞机制研究提供了理论基础，并为ASD相关药物开发和临床治疗提供新的思路和线索。