褪黑素腹腔注射对急性脑梗死大鼠神经细胞损伤凋亡的改善作用及其机制

王琮民，闫纪琳，李海涛，牛丽辉，王敏，姜黎黎

1 河北工程大学附属医院神经内科，河北邯郸056000；2 河北工程大学医学院；3 邯郸市中心医院神经内科

急性脑梗死是临床常见的脑血管疾病，又称缺血性脑卒中，多发于中老年人，患病率以及致残率、致死率均极高［1-2］。急性脑梗死的发生发展与组织中活性氧自由基过量、神经元凋亡、炎症反应及血脑屏障被破坏等都有密切联系［3］。褪黑素是由松果体分泌的一种胺类激素，存在于多种细胞、组织和器官中，作为一种抗氧化剂来调节不同病理条件下的氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡等多种分子途径［4］，具有减轻氧自由基损伤和炎症反应、调节细胞自噬、抑制细胞凋亡等作用［5］。国内外研究［6］表明，当脑组织受到严重创伤时，血清中产生大量的内源性褪黑素，消除细胞中产生的ROS，减少神经元死亡，在严重创伤性脑损伤、缺血再灌注脑损伤中均有一定的治疗作用。Notch1 是Notch 信号通路的同源受体，在细胞生长进程中起着重要作用。研究［7］表明，Notch信号通路参与细胞生长以及神经元的调节，在神经细胞的增殖、凋亡和分化中发挥重要的作用。发状分裂相关增强子1（hairy enhancer of split 1，Hes1）是一种碱性螺旋—环—螺旋（BHLH）家族的转录因子，是Notch1 信号通路下游的一个重要的效应因子，其通过促进下游基因的表达，参与神经干细胞的维持与增殖分化［8-9］。许多研究［10］发现，Notch1/Hes1 信号通路参与调控缺血性脑卒中引起的细胞凋亡、血脑屏障受损等，发挥修复作用。Notch1/Hes1 信号通路能够维持神经细胞未分化前的状态，促进细胞分化方向的选择［11］，在脑缺血再灌注损伤中调控神经细胞的分化、增殖以及凋亡等［12］。褪黑素是否能够通过调控Notch1/Hes1 信号通路来改善急性脑梗死大鼠神经细胞凋亡尚不明确，2021 年7月16 日—2021 年9 月3 日，我们通过建立大鼠急性脑梗死模型，观察了褪黑素腹腔注射对急性脑梗死大鼠神经细胞损伤凋亡的改善作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1. 1 大鼠、试剂及仪器 SPF 级SD 大鼠60 只，8 周龄，体质量为（300 ± 20）g，购买于中国科学动物研究所，动物许可证号为SYXK（京）2018-0021。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，温度为25 ℃，湿度为60%，适应性饲养1 周后开始实验。褪黑素注射液购自Sigma-Aldrich 公司；尼莫地平购自济川药业集团有限公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Notch1、Hes1、β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自Abcam公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白裂解液（RIPA）购自上海研谨生物科技有限公司；Western blotting DAB 法显色试剂盒购自北京康纳瑞生物科技有限公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、苏木精—伊红染色剂购自碧云天生物科技公司。Gel Doc2000 凝胶成像系统购自Bio-RAD 公司；尼康SMZ745光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司；艾卡ULTRA-TURRAX 匀浆机购自艾卡（广州）仪器设备有限公司；艾本德5427 R 台式冷冻离心机购自Eppendorf 艾本德中国有限公司；SpectraMax iD5 酶标仪购自美股谷分子仪器（上海）有限公司。

1. 2 大鼠分组、急性脑梗死模型制备、褪黑素给予方法 60 只SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、褪黑素低剂量组、褪黑素中剂量组、褪黑素高剂量组、阳性对照组，每组10只。除假手术组外，其他5组参照文献［13］建立急性脑梗死模型：SD 大鼠术前禁食禁水12 h，腹腔注射3% 戊巴比妥钠（35 mg/kg）进行麻醉，颈部正中切口，并钝性分离颈总动脉与颈外动脉，采用0号手术线分别结扎颈总动脉和颈外动脉，阻断动脉血液流动；在颈总动脉分叉下方剪一缺口，将肝素预处理尼龙线栓插入颈内动脉，有明显阻力时停止插入，剪掉线栓尾端，并在颈内动脉根部固定，清洗消毒后逐层缝合皮下组织及皮肤。术后腹腔注射2万单位青霉素，注意大鼠体温和保暖，侧卧位保持呼吸道通畅。假手术组大鼠仅游离颈总动脉，不进行结扎操作。造模成功后稳定30 min 开始给药，褪黑素低剂量组、褪黑素中剂量组、褪黑素高剂量组分别给予褪黑素5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg，同一时间，假手术组与模型组给予相同体积的生理盐水，阳性对照组给予尼莫地平15 mg/kg。给药方式均为腹腔注射，每日1次，共给药7 d。

1. 3 各组大鼠神经功能缺损评分 给药结束后24 h，根据Longa生物学评分法评估大鼠神经功能缺损情况。0 分：小鼠活动完全正常、无神经功能缺损症状；1 分：将小鼠提尾悬空后其出现左侧前肢屈曲、肘关节伸直；2 分：小鼠爬行时向左侧转圈并且侧推时左右推动的阻力不等；3 分：左侧肢体肌力明显减退导致其不能承受体重而向左侧倾倒；4 分：呈筒样滚动或无自主活动，出现意识障碍。

1. 4 各组大鼠血清氧化还原指标及炎性因子测定 各组大鼠神经功能缺损评分结束后迅速麻醉大鼠，心脏取血，4 000 r/min 离心15 min，采用酶联免疫吸附法检测血清中氧化还原指标MDA、SOD 及炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β。

1. 5 各组大鼠脑组织神经细胞损伤及凋亡情况观察 取血后处死大鼠，开颅分离脑组织，每组随机取部分脑组织采用4% 多聚甲醛进行固定，之后进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋后制作4 μm 左右的切片，进行苏木精—伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察各组脑组织病理学变化。取各组大鼠脑组织切片，经脱蜡、乙醇梯度水化后，按照TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书要求检测大鼠脑组织神经细胞凋亡情况，计算神经细胞凋亡率。

1. 6 各组大鼠脑组织中Notch1/Hes1 信号通路相关蛋白Notch1、Hes1 检测 取-80 ℃冰箱保存的大鼠脑组织，加入裂解液制备匀浆，运用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定匀浆液中总蛋白含量，加5 倍蛋白上样缓冲液置于沸水中10 min 使蛋白充分变性。取等量蛋白样品上样，SDS-PAGE 电泳后转移至PVDF 膜上，5% BSA 封闭1 h，加入Notch1、Hes1 和内参β-actin 一抗稀释液，4 ℃冰箱孵育12 h以上；冲

洗后再加入辣根过氧化物酶标记二抗，常温下孵育60 min，冲洗后加显色液显色，按照DAB显色试剂盒说明书进行操作，应用凝胶成像系统扫描电泳结果，以β-actin 为内参进行灰度值分析，计算Notch1、Hes1的蛋白相对表达量。

1. 7 统计学方法 采用SPSS22. 0 统计软件。计量资料呈正态分布时以-x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。P＜0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 假手术组大鼠未发现神经功能缺损症状，计0 分；模型组、褪黑素低剂量组、褪黑素中剂量组、褪黑素高剂量组、阳性对照组大鼠神经功能缺损评分分别为（3. 91 ±0. 63）、（3. 23 ± 0. 52）、（2. 67 ± 0. 45）、（1. 84 ±0. 47）、（1. 66 ± 0. 43）分，其中褪黑素高剂量组大鼠神经功能缺损评分与阳性对照组相比，P＞0. 05，其余组间相比，P均＜0. 05。

2. 2 各组大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 各组大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比较见表1。由表1 可知，褪黑素高剂量组血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平与阳性对照组相比，P均＞0. 05；其余各组大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β水平组间相比，P均＜0. 05。

表1 各组大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较（-x±s）

2. 3 各组大鼠脑组织神经细胞损伤及凋亡情况比较 各组大鼠脑组织病理学检查结果见图1。由图1 可见，假手术组大鼠脑组织神经细胞排列整齐有序、大小一致、形状完整，细胞结构清晰，且分布均匀正常，未出现水肿变性；与假手术组相比，模型组大鼠脑组织神经细胞受损严重，细胞分布稀疏凌乱，细胞空泡化严重，细胞核溶解现象严重；与模型组相比，褪黑素低剂量组、褪黑素中剂量组、褪黑素高剂量组、阳性对照组细胞病变现象减轻，褪黑素低剂量组与褪黑素中剂量组中少数细胞空泡化，细胞分布较整齐，细胞核溶解固缩现象减少，褪黑素高剂量组以及阳性对照组未见细胞核溶解固缩现象，细胞分布均匀整齐，与假手术组几乎一致。假手术组、模型组、褪黑素低剂量组、褪黑素中剂量组、褪黑素高剂量组、阳性对照组大鼠脑组织神经细胞凋亡率分别为4. 02%± 0. 67%、48. 18%± 5. 23%、32. 26%± 3. 24%、25. 28%± 2. 63%、12. 82%± 1. 56%、12. 54%± 1. 23%，其中褪黑素高剂量组大鼠脑组织神经细胞凋亡率与阳性对照组相比，P＞0. 05，其余组间相比，P均＜0. 05。

图1 各组大鼠脑组织病理学检查结果（HE染色，×400）

2. 4 各组大鼠脑组织中Notch1、Hes1 蛋白相对表达量比较 各组大鼠脑组织中Notch1、Hes1 蛋白相对表达量比较见表2。由表2可知，褪黑素高剂量组大鼠脑组织中Notch1、Hes1蛋白相对表达量与阳性对照组相比，P均＞0. 05；其余各组大鼠脑组织中Notch1、Hes1蛋白相对表达量组间相比，P均＜0. 05。

表2 各组大鼠脑组织中Notch1、Hes1蛋白相对表达量比较（-x±s）

3 讨论

急性脑梗死是现在临床医学备受关注和亟待解决的一种脑血管疾病，其发病突然、难治愈，严重威胁人类的生命健康。急性脑梗死的发生发展与氧化应激、炎性反应以及细胞凋亡均有密切联系。研究［14］证明，当机体内氧自由基过量产生，细胞内脂质氧化生成MDA，SOD 作为机体内中重要的抗氧化酶被大量消耗，脑缺血早期TNF-α、IL-6 等炎症因子诱发炎症反应导致脑组织受损［15］。另外脑梗死会造成缺血缺氧中心区的神经细胞受到氧化应激以及炎症反应的刺激产生不可逆的损伤，迅速凋亡［16］。本研究结果显示，急性脑梗死模型大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 以及MDA 含量均明显升高，SOD活性明显降低，神经细胞凋亡增多，与之前学者的研究结果一致。细胞凋亡是细胞维持自身稳定的重要机制，近年来研究［17］表明，急性脑梗死发生后缺血半暗区神经细胞凋亡是治疗脑梗死的关键，因此利用药物的保护作用抑制缺血半暗区细胞凋亡对减轻急性脑梗死损伤具有重要的研究意义。

褪黑素是一种吲哚类激素，它具有高亲和性，容易通过血脑屏障作用到受损神经组织，发挥缓解炎症反应，减轻氧化应激损伤以及抗细胞凋亡等作用［18］。研究［19］发现，褪黑素可以通过诱导抗氧化酶生成、清除组织中氧自由基、抑制细胞凋亡等途径改善神经组织受损。也有学者研究［20］表示，褪黑素能够通过抑制NF-κB 信号通路介导的炎症反应，改善大鼠创伤性脑损伤后认知功能障碍。本研究结果表明，褪黑素可以通过调控炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和氧化还原指标MDA、SOD 的释放，减轻氧化应激，抑制炎症反应，达到抗神经细胞凋亡以及改善急性脑梗死后神经功能的作用。

Notch1/Hes1 信号通路参与缺血再灌注损伤，修复神经组织受损，调控细胞结构和功能的发育［21］，Notch1 通路的激活导致神经细胞受损，引起神经元凋亡，诱导脑功能障碍［22］，使用其抑制剂可以减轻神经元凋亡，对缺血神经元起到保护作用［23］。Hes1 是Notch1 信号的靶基因，Notch1 被激活后可与其相应配体结合，诱导Hes1 转录，因此其表达水平是评估Notch信号表达的重要指标［24］。也有研究［25］证明，激活Notch1/Hes1 信号通路可以促进海马区神经干细胞的增殖与分化，来改善脑卒中后大鼠的神经功能障碍。因此，Notch1/Hes1 信号通路的激活既有利又有弊，适当促进Notch1/Hes1 信号通路激活可以诱导神经干细胞的增殖与分化，抑制神经元凋亡；但Notch1/Hes1 信号通路过度激活会诱导炎性因子及氧自由基的释放，炎症反应和氧化应激反应增强，造成神经细胞受损，凋亡率升高。本研究通过设计急性脑梗死大鼠模型，利用褪黑素作为药物干预，结果显示模型组大鼠脑组织中Notch1、Hes1 蛋白表达显著升高，即Notch1/Hes1 通路被激活；而褪黑素各剂量组大鼠脑组织中Notch1、Hes1 的蛋白表达较模型组明显下降，表明褪黑素可抑制Notch1/Hes1 通路激活。

综上所述，急性脑梗死发生时，机体内炎症反应以及免疫应激反应过表达，导致机体受损，Notch1/Hes1 通路被激活，诱导神经元凋亡，导致神经功能受损。褪黑素干预后的急性脑梗死大鼠体内炎性因子以及氧化应激指标水平均明显改善，Notch1/Hes1通路相关蛋白的表达降低，神经元凋亡率降低，改善神经功能。因此高剂量（15 mg/kg）褪黑素腹腔注射可改善急性脑梗死大鼠的神经细胞损伤凋亡情况，其机制可能与下调Notch1/Hes1 信号通路相关蛋白Notch1、Hes1 的表达有关，为急性脑梗死神经功能障碍提供了一种新的治疗手段。 但褪黑素对Notch1、Hes1 的蛋白表达的具体作用机制尚不清晰，仍需设计实验进一步研究其调控机制。