降脂消斑片对动脉粥样硬化小鼠血脂、IL-1β及Caspase-8的影响*

冯 君 卢豆豆，2 冉俊宁 唐聪聪 刘慧慧 刘建和△

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004）

动脉粥样硬化是一组常见且重要的血管疾病，系指因吸烟、高血脂、糖尿病等多种危险因素作用于血管内皮细胞后，致使内皮功能受损、通透性改变、血脂大量沉积到内膜下为主要特征的病理过程，晚期可堵塞管腔，阻滞血流，造成组织器官缺血缺氧，是心肌梗死、脑血管意外等多种危急病症的重要危险因素［1］。有研究发现［2-4］，炎症反应、细胞凋亡均参与动脉粥样硬化的发生发展。本文探讨中药对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠血脂、白细胞介素-1β（IL-1β）及半胱氨酸蛋白水解酶-8（Caspase-8）蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠20只，体质量20～25 g，4周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号DWDG-202009280002。采用高脂饲料喂养（7%猪油、5%胆固醇、3%白砂糖、0.5%胆酸钠、84.5%基础饲料）建立动脉粥样硬化模型。所有小鼠均饲养于湖南中医药大学动物实验中心动物房，随意饮食饮水，保持饲养室通风情况良好，温度（22±0.5）℃，昼夜交替12 h光照，均受人道对待。

1.2 药物

降脂消斑片（院内制剂，湘药制备字Z20190067000），成分为大黄、虎杖、黄芪、当归，由湖南中医药大学第一附属医院制剂中心提供，每粒0.4 g，成人用量为每次1.6 g，每日3次。阿托伐他汀钙（辉瑞公司生产，国药准字H20051408）。

1.3 试剂与仪器

苏木精-伊红染液（Wellbio）；IL-1β ELISA试剂盒（酶联生物工程有限公司，01/2021）；Caspase-8蛋白抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，Proteintech，66093-1-Ig）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1650R）；全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司，PW-812）；多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，MB-530）；电热恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器有限公司，DHP-500）；切片刀（莱卡，M199）；切片机（浙江金华益迪试验器材，YD-315）；包埋机（常州中威电子仪器，BMJA）；光学显微镜（Motic，BA410T）等。2.5%羧甲基纤维素钠（阿拉丁，货号C104984）。

1.4 分组及造模

小鼠经检疫后适应性饲养3 d，期间给予普通饲料，3 d后随机分为正常组、模型组、西药组、中药组，每组5只，每鼠笼5只分开饲养。分组完成后，正常组给予普通基础饲料饮食，其余3组均给予动脉粥样硬化模型饲料（购自北京科澳协力饲料有限公司），喂养12周建立动脉粥样硬化模型。

1.5 给药方法

喂养第6周时开始药物干预，预防性给药6周。根据换算公式换算系数Rab=12.33，模型组给予2.5%羧甲基纤维素钠水溶液1.5 mL/kg灌胃，西药组给予阿托伐他汀钙4.1 mg/kg灌胃，中药组给予降脂消斑片984 mg/kg灌胃，每日1次。灌胃时间是每日上午给食前，每隔2～3 d记录小鼠精神状况、毛发光泽度、肢体活动及体质量。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 血脂检测 12周后小鼠禁食12 h过夜，眼球取血，样本在4℃冰箱放置过夜，1 500g离心10 min，吸取上层血清，放入专用试管，使用超微量动物专用多功能全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

1.6.2 ELISA法检测IL-1β 处死小鼠取20 mg主动脉组织，用PBS洗去血污，剪成小块放入组织研磨器（匀浆管）中，加入0.2 mL 1×PBS制成匀浆，然后置于-20℃过夜。经过反复冻融2次过夜处理破坏细胞膜后，将组织匀浆于2～8℃5 000g离心5 min取上清。取适量上清液立即进行实验，采用ELISA方法，严格按照试剂盒说明书进行操作，检测IL-1β的表达。

1.6.3 免疫组化法检测Caspase-8蛋白 制作主动脉组织切片，0℃烤片、切片脱蜡至水；热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），微波炉加热至沸腾后断电，连续煮20 min后冷却20 min拿出，冷却至室温。用0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.6）洗涤3 min，重复3次；使用1%高碘酸室温下10 min灭活内源性酶；滴加鼠抗Caspase-8抗体（1∶100）孵育过夜，滴加二抗，DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤终止显色，脱水封片。应用Image j软件对每张图片进行分析，得出测量面积（A）与累积吸光度（IOD），IOD/A作为每一张图片的平均光密度（AOD），AOD值越大，提示阳性表达越强。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠一般体征比较

在适应性喂养期间，小鼠精神、活动及皮毛均正常。造模期间，模型组、西药组及中药组小鼠体质量增长较正常组快，毛皮更为光亮。实验中后期，各组小鼠均生长良好，模型组动物情绪易怒，易被惊吓，进食量少。

2.2 各组小鼠血脂水平比较

见表1。与正常组相比，模型组TC、LDL-C水平均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明动脉粥样硬化模型建立成功；模型组、对照组及中药组的TC、LDL-C水平较正常组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，各用药组TC、LDL-C水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；西药组与中药组差异无统计学意义。

表1 各组小鼠血清TC和LDL-C水平比较（mmol/L，±s）

表1 各组小鼠血清TC和LDL-C水平比较（mmol/L，±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别正常组模型组西药组中药组n 5 5 5 5 TC 2.23±0.16 4.56±1.01**3.67±0.70**△3.65±0.21**△LDL-C 0.47±0.11 1.88±0.68**0.89±0.15△△1.02±0.12*△△

2.3 各组小鼠炎症因子IL-1β水平比较

见表2。与正常组相比，模型组血清中的IL-1β含量显著高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，西药组和中药组的IL-1β含量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；西药组与中药组无明显差异。

表2 各组小鼠血清中IL-1β水平及主动脉组织Caspase-8蛋白表达比较（±s）

注：与西药组比较，☆P＜0.05。

组别正常组模型组西药组中药组Caspase-8 0.26±0.01 0.29±0.01**0.27±0.01△0.25±0.02△△☆n 5 5 5 5 IL-1β（ng/L）26.37±3.85 33.10±3.44**25.40±1.57△△26.21±4.45△△

2.3 各组小鼠主动脉Caspase-8凋亡蛋白表达的比较

见表2，图1。Caspase-8阳性着色可见细胞质中均匀分布棕黄色颗粒，主要表达在小鼠的主动脉。与正常组比较，模型组Caspase-8的表达显著增强（P＜0.01）。与模型组相比，西药组、中药组Caspase-8表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与西药组相比，中药组Caspase-8表达下降更明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

目前关于动脉粥样硬化的形成机制有很多假说，研究较多的是脂质浸润学说。当多种病损原因致使血管内皮受损后，低密度脂蛋白逐渐沉积在管壁上，单核细胞与淋巴细胞募集到受损部位，并转化为巨噬细胞，吞噬氧化后的低密度脂蛋白，完成清理工作的巨噬细胞变成泡沫细胞，而活化的巨噬细胞可释放炎症因子IL-1β和脂质等物质，吸引更多的单核细胞聚集，诱发细胞凋亡，加剧动脉粥样硬化的进展。IL-1β属于炎症因子的一种，主要参与机体免疫调节，可导致炎症的持续与放大［5］。临床研究表明［6］，动脉粥样硬化血清中的IL-1β较正常人明显下降。Caspase是一类同型半胱氨酸家族的蛋白，可在特定的氨基酸序列上切割底物，其中Caspase-8是与细胞凋亡最为密切的相关蛋白之一，是细胞凋亡的关键调控蛋白，在细胞凋亡中占主导作用，广泛表达于各种组织中，以血液淋巴细胞中表达最为丰富。细胞受到应激原信号刺激后，可分泌TNF-α，募集多种蛋白包括TNFR1相关死亡域（TRADD）、受体相互作用蛋白激酶 1（RIPK1）、Caspase-8等组成复合体，Caspase-8的活化进一步触动信号通路下游的其他Caspase因子，最终发动级联反应，通过这一过程启动细胞凋亡的开始。故我们推测炎症反应、细胞凋亡均与动脉粥样硬化的形成、发展相关。

动脉粥样硬化在中医古籍文献中并无相对应的名称，根据其发病特点及临床表现，可归属于中医学的“痰饮”“瘀血”“脉痹”“血浊”等范畴。恣食肥甘膏粱厚味之品，加重脾司运化、胃主腐熟的负担，运化失司，代谢紊乱，水饮停聚，生成痰湿、脂浊，滞留血中；而湿又最易困脾，阻碍气机，加重脾之虚弱。《金匮要略》记载“血不利则为水”，痰液阻道，气机不利，可致血行不畅，变生瘀血，最终形成痰瘀胶结，渗透血脉。故选用高脂饲料诱导动脉粥样硬化小鼠模型。

降脂消斑片是本院程丑夫教授根据多年临床经验，结合理论指导研制而成，主要由大黄、虎杖、黄芪、当归组成，应用于临床多年，疗效确切。前期通过临床试验发现［7-8］，降脂消斑片可减轻临床症状，稳定斑块，还可降低患者血清中CRP、IL-1β等炎性指标水平。动物实验亦表明［9-11］，该药可降低血管内皮脂质浸润程度，下调TNF-α、PI3K等蛋白的表达，减轻粥样斑块的形成与进展。方中虎杖具有“压一切热毒”之功，为君药；大黄降气通腑泄浊，为臣药；当归补血活血，谓血中之气药，血中之圣药，黄芪健脾益气，升举阳气，益气行血，气行则血行，二者配伍，共奏行气活血之功，共为佐使药。全方共奏升清降浊，化痰活血之功效。虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、当归挥发油等是方中的主要化学成分，实验表明可调节血脂紊乱、抗脂质过氧化、改善血管内皮损伤而发挥抗动脉粥样硬化的作用［12-15］。

本研究发现，与正常组相比，模型组小鼠血清中TC、LDL-C含量显著增加，说明经高脂饮食干预后，出现了明显的血脂异常。与模型组相比，西药组与中药组的TC、LDL-C水平下降，表明阿托伐他汀钙与降脂消斑片能纠正小鼠动脉粥样硬化病理过程中异常的血脂代谢。与正常组相比，模型组血清中的IL-1β表达含量显著升高，提示炎症反应参与动脉粥样硬化的形成过程；免疫组化显示模型组Caspase-8蛋白表达含量显著高于正常组，提示细胞凋亡反应参与动脉粥样硬化的发生；西药组和中药组Caspase-8表达显著降低，表明阿托伐他汀钙片与降脂消斑片可抑制动脉粥样硬化炎症的发生。

综上所述，降脂消斑片通过参与调节动脉粥样硬化小鼠的血脂水平、炎症及凋亡反应，实现对动脉组织的保护作用。本研究阐明了降脂消斑片抗动脉粥样硬化进展的物质基础，其具体通路机制可在今后的实验中进一步探讨研究。