两种海洋真菌混合发酵的次级代谢产物及杀虫活性研究

曹 云, 侯宗敏, 董存柱, 曹凤勤, 陶 敏,余森泉, 夏玉莲, 伍显锋

(海南大学 植物保护学院，热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海口 570228)

海洋真菌在特殊的生存环境下生命力强，不仅具有特殊的代谢途径和防御体制，还能够产生大量结构新颖、功能丰富的次生代谢物，已成为研发新型药物先导化合物的热点[1]。截至目前，从海洋真菌的次生代谢产物中已分离鉴定出大量结构新颖的化合物，部分化合物表现出良好的抗肿瘤、抗菌或抗病毒等药理学活性[2-3]。黄瑞环从哈茨木霉Trichoderma hrzianum的次生代谢产物中分离得到两个Nafuredin 类化合物，发现其对稻瘟病菌均具有抑制作用[4]。Gao 等从短柄青霉菌Penicillium brefeldianum次生代谢物中分离出3 种新化合物，发现部分化合物对人类肿瘤细胞HepG2 和 MDA-MB-231 表现出细胞毒性[5]。

微生物混合发酵由来已久，已广泛应用于传统微生物工业和食品工业。Cueto 等发现，当海洋真菌Pestalotiasp. CNL-365 与一株对抗生素有抗性的海洋细菌CNJ-328 进行混合发酵时，可以产生一个新的抗生素pestalone，而单独发酵则不产生该化合物[6]。因此，将微生物混合发酵技术运用于海洋真菌次级代谢产物的研究，有望挖掘出大量结构新颖的活性化合物[7-8]。

基于此，本研究将来源于海南东寨港红树林海泥中的哈茨木霉T. harzianumABC19819 和短柄青霉菌P. brefeldianumABC190807 进行混合发酵，对其次级代谢产物进行了系统的分离鉴定，从中分离得到6 个化合物，采用波谱分析技术并通过文献对比，对化合物的结构进行了鉴定，并以埃及伊蚊Aedes aegypti3 龄幼虫试虫测定了6 个化合物的杀虫活性。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 仪器与试剂 Bruker DRX-600 型核磁共振波谱仪 (T M S 为内标，德国B r u k e r 公司)；Finnigan LCQ Advantage MAX 型液相色谱-质谱联用仪 (美国热电公司)；立式压力蒸汽灭菌锅YM75(上海三申医疗器械有限公司)；冷却水循环装置CA-1111 和水流抽气机A1000S (日本EYELA公司)；凝胶Sephadex LH-20 (美国GE 公司)；硅胶薄层色谱板GF254 和柱色谱用硅胶60～80 目(筛孔径180～250 μm)，200～300 目 (筛孔径48～75 μm) (青岛海洋化工集团公司)，柱色谱试剂均为国产分析纯，琼脂粉、葡萄糖、75% 乙醇、99.5%二甲基亚砜(西陇科学股份有限公司)；鱼藤酮 (rotenone，纯度为95%，Aladdin 试剂公司)；99.8%氘代试剂 (北京伊诺凯科技有限公司)。

1.1.2 试验菌株 菌株Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807分离于海南东寨港红树林海泥，菌种由海南大学植物保护学院天然源农药实验室通过分子生物学与形态学进行鉴定并保存。埃及伊蚊Aedes aegypti3 龄幼虫由海南大学植物保护学院化保实验室提供。

1.1.3 菌种纯化 无菌操作下，将适量样品置于含有50 mL 无菌海水的100 mL 三角瓶中，搅拌均匀，静置。吸取1 mL 上清液于含有9 mL 无菌海水的20 mL 试管中，按照浓度梯度稀释法配制成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的溶液[9]。取150 μL各浓度溶液加入PDA 培养基 (3 个重复) ，以涂布器涂布均匀，将培养皿封口，倒置培养。观察菌种生长情况，用接种针挑取出新长出的菌丝接种到空白PDA 培养基上，待新培养基上的真菌长出菌丝后，重复操作，直到得到纯化真菌，并进行菌种保藏备用。

1.1.4 发酵培养 海水PDB 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，以海水定容至1 000 mL。发酵培养基：1 000 mL 发酵瓶，大米80 g，天然海水100 mL。

将保藏的菌种活化备用。配制10 瓶PDB 液体培养基和135 瓶发酵培养基，灭菌后待用。将纯化的2 株真菌各自接入5 瓶PDB 培养基中，于26 ℃、180 r/min 的条件下培养3 d，作为真菌种子液。分别接种3 mL 真菌种子液到135 瓶发酵培养基中，于26 ℃静置混合发酵培养45 d。

1.2 试验方法

1.2.1 提取与分离 发酵45 d 后，向每个发酵瓶中加入600 mL 乙酸乙酯，捣碎搅拌后静置3 d，期间振荡若干次。抽滤，浓缩得到发酵液浸膏；回收乙酸乙酯后再次加入提取，如此反复3 次。合并浸膏，共得到浸膏394.14 g，置入4 ℃冰箱内备用。以60～80 目硅胶拌样 (硅胶与样品质量比为1 : 1)，200～300 目硅胶装柱分离样品。先用薄层层析 (TLC) 法确定分离系统：以石油醚-乙酸乙酯 (体积比分别为100 : 0, 95 : 5, 90 : 10, 85 : 15,80 : 20, 75 : 25, 70 : 30, 65 : 35, 60 : 40, 55 : 45, 50 :50, 45 : 55, 40 : 60, 35 : 65, 20 : 80, 0 : 100) 进行梯度洗脱，再用乙酸乙酯-甲醇 (体积比90 : 10, 65 :35, 30 : 70, 0 : 100) 洗脱。经检验，合并得到18 个部分 (Fr.1～18)。Fr. 1，1.76 g；Fr. 2，1.37 g；Fr. 3，1.59 g；Fr. 4，9.51 g；Fr. 5，2.07 g；Fr. 6，2.15 g；Fr. 7，3.64 g；Fr. 8，5.07 g；Fr. 9，3.17 g；Fr. 10，2.76 g；Fr. 11，3.15 g；Fr. 12，2.77 g；Fr. 13，3.29 g；Fr. 14，2.35 g；Fr.15，2.69 g；Fr. 16，1.71 g；Fr. 17，1.53 g；Fr. 18，1.43 g。将所得各部分进行分离纯化。Fr. 1-2、Fr. 5 和Fr. 9-18 因其所含化合物过于混杂，在分离过程中没有得到纯化合物。Fr. 3 经凝胶柱色谱V(甲醇) :V(氯仿) =1 :1 洗脱得化合物1 (63.7 mg)。Fr. 4 经硅胶柱色谱V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =90 : 10 洗脱得到Fr. 4-1，经硅胶柱色谱V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =85 :15 洗脱得到Fr. 4-2；Fr. 4-1 经凝胶柱色谱V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脱得化合物2 (158.8 mg)。Fr. 4-2 经凝胶柱色谱V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脱得化合物3 (78.9 mg)。Fr. 6 经硅胶柱色谱V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =65 : 35 洗脱得到Fr. 6-1，Fr. 6-1 经凝胶柱色谱甲醇洗脱得化合物4 (58.2 mg)。Fr. 7 经硅胶柱色谱V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =70 :30 洗脱得到Fr. 7-1，Fr. 7-1 经凝胶柱色谱V(甲醇) :V(氯仿) =1 : 1 洗脱得化合物5 (84.6 mg)。Fr. 8 经凝胶柱色谱甲醇洗脱得化合物6 (103.5 mg)。

1.2.2 化合物的结构鉴定

化合物4：白色针状晶体 (甲醇) ，熔点为210 ℃。其NMR 数据与文献[16]报道一致。1H NMR (600 MHz, DMSOd6),δ: 5.98 (s, H-C(5), 1H)，2.13 (s, H-C(8), 3H)，1.73 (s, HC(7), 3H)；13C NMR (151 MHz, DMSO-d6),δ: 165.0 (C=O,C-2)，164.9 (C=C, C-4)，159.2 (C=C, C-6)，99.7 (C=C, C-5)，96.2 (C=C, C-3), 19.1 (CH3, C-8)，8.2 (CH3, C-7)。ESIMS (m/z): 139 [M-H]-给出分子离子峰，结合1H NMR 和13C NMR 数据，推导其分子式为C7H8O3，结合文献数据 (熔点为209～211 ℃[17])，鉴定化合物4 为4-羟基-3, 6-二甲基-2H-吡喃酮。

6 种化合物的结构式见图式1。

图式1 化合物1～6 的化学结构Scheme 1 Structures of compounds 1-6

1.3 杀虫活性测定

1.3.1 对埃及伊蚊的活性初筛 分别称取25 mg供试化合物，加入1 mL 二甲基亚砜溶解，用去离子水定容至50 mL，得到化合物质量浓度为500 mg/L的药液，备用。以相同质量浓度的鱼藤酮作为药剂对照，以含等量溶剂的去离子水溶液作为空白对照。采用浸渍法[22]测定各化合物对埃及伊蚊3 龄幼虫的杀虫活性。每处理重复3 次，每重复用滴管吸取20 只大小均一、发育一致的埃及伊蚊3 龄幼虫。分别于处理后12、24、36 和72 h 统计结果，记录幼虫死亡数，并计算校正死亡率。以虫体僵直、尾部明显变黑，浮于药液上或沉于底部者判为死亡。

1.3.2 测定高活性化合物对埃及伊蚊的LC50值

以含1 mL 二甲基亚砜的去离子水为溶剂，配制质量浓度为4 000 mg/L 的母液，继而用去离子水稀释成系列质量浓度分别为400、300、200、100 和50 mg/L 的药液。处理方法同1.3.1 节，于72 h 观察记录死亡虫数，采用DPS v9.50 软件统计分析72 h 试虫死亡结果，并计算LC50值。

1.3.3 数据处理 分别按公式 (1)、 (2) 计算死亡率(M1)和校正死亡率(M2)：

式中：K为死亡虫数，N为处理总虫数，M0为空白对照组的死亡率。

采用DPS v9.50 软件统计分析不同处理间的差异显著性 (Duncan’s 新复极差测定法)，采用毒力回归方法进行毒力测定[23]。

2 结果与分析

2.1 杀虫活性

结果 (表1) 表明，在分离得到的6 个化合物中，只有化合物1 和3 对埃及伊蚊3 龄幼虫表现出不同程度的毒杀活性，且致死率均随时间的延长而增加，其中在72 h 时，化合物1 的校正死亡率达100%，化合物3 的校正死亡率达80%以上，故对这两个化合物进一步进行了毒力测定。

表1 500 mg/L 化合物1～6 对埃及伊蚊3 龄幼虫的杀虫活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

表1 500 mg/L 化合物1～6 对埃及伊蚊3 龄幼虫的杀虫活性Table 1 The insecticidal activities of compounds 1-6 at 500 mg/L against the third instar larvae of Aedes aegypti (±SD, n = 3)

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著 (P＜0.05，DMRT 法) ；“—” 表示无毒杀作用。Note: Data followed different letters within colum indicate significant differences at 0.05 level. "—" indicate no larvicidal activity.

X±SD校正死亡率 (, n = 3)成分Compounds Adjusted mortality rate/%12 h24 h36 h72 h 173.33±7.64 b 83.33±2.89 b 86.67±2.89 b 100.00±0.00 a 2——6.67±3.33 c 358.33±2.89 c 70.00±5.00 c 78.33±5.77 c 81.66±2.89 b 4———8.33±2.89 c 6——5——CK——鱼藤酮 rotenone 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a 100.00±0.00 a

线性回归分析结果 (表2) 表明：化合物1 和3 对埃及伊蚊3 龄幼虫的毒力在72 h 后均呈现清晰的剂量-效应关系。化合物1 和3 的LC50值分别为162 mg/L 和240 mg/L，高于鱼藤酮的LC50值13.4 mg/L，说明两个化合物杀虫活性不如鱼藤酮。

表2 72 h 化合物1 和3 对埃及伊蚊3 龄幼虫的LC50 值Table 2 LC50 value of compound 1 and 3 after 72 h against the third instar larvae of Aedes aegypti

3 结论与讨论

本研究从海洋真菌Trichoderma harzianumABC19819 和Penicillium brefeldianumABC190807混合发酵的次级代谢产物中分离得到6 个化合物，分别鉴定为agathic acid (1)、4-羟基苯甲醛(2)、nafuredin (3)、4-羟基-3,6-二甲基-2H-吡喃酮(4)、甲瓦龙酸内酯 (5)和brefeldin A (6)。其中化合物1 和3 表现出明显的杀埃及伊蚊幼虫活性，进一步表明了混合发酵技术有可能成为寻找活性天然产物的有效途径。混合发酵与单独发酵获得的次生代谢物有所不同，单独发酵时，从哈茨木霉主要分离出二肽类化合物[4], 从短柄青霉菌中主要分离出吲哚生物碱[24]，而混合发酵可以除同时分离出两种真菌所具有的次生代谢物，如化合物Nafuredin，还可以分离出单独发酵时未获得次生代谢物，如化合物agathic acid。据文献报道，agathic acid 具有抗炎、抗病毒活性[25]；nafuredin具有抗菌活性[26]，而有关agathic acid 和nafuredin的杀虫活性未见报道，本研究丰富了其杀虫活性。另外，两个活性化合物的结构相对简单，易于进行结构修饰，可作为研发生物杀虫剂的先导化合物进一步研究。