香皂产品除菌效果应用研究

杨 洁 姚晨之, 严 方, 王 杰 孟丽君

1.中国日用化学工业研究院，山西太原，030001；2.中轻日用化学检验认证有限公司，山西太原，030001

香皂是日常生活中不可缺少的卫生清洁用品。随着科学技术的进步、人民生活水平的提高以及公共卫生理念的不断完善，消费者希望香皂除了基本的去污功效，还能具有除菌功效。生产商为了适应市场的需求，纷纷推出各种具有除菌功效的产品[1-3]。

目前，“除菌”对于卫生清洁用品仅是个概念宣传，事实上，日化行业对于卫生清洁用品尚没有统一明确的关于“除菌”的定义和评价标准。现有涉及产品微生物功效作用方面，有明确定义的是“抗/杀菌”“抑菌”，如行业标准QB/T 2738—2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》[4]。抗菌或抑菌是指采用化学或物理的方法杀灭/抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程，“除菌”概念最先由业内部分生产企业提出，根据字面含义，可以认为是指采用物理化学的方法洗去载体表面上附着的细菌并妨碍其生长繁殖的过程。产品洗去细菌的效果可以通过模拟实际洗涤过程检验。国外已有与手部卫生用品除菌效果相关的标准方法，如美国材料测试协会的标准ASTM E117413[5]和ASTM E289712[6]，前者规定了通过人体试验法评价除菌洗手液在洗手过程中除菌效果的测试方法，后者为通过体外模拟法评价手部卫生用品除菌效果的测试方法。ASTM E117413中人体试验法的实际操作难度较大，且会对受试者带来一定的风险；ASTM E289712中尚未对体外模拟法的具体试验条件进行规定。此两项国外标准中推荐的试验菌种为黏质沙雷菌和大肠埃希菌，缺少国内日化行业抗抑菌常用的推荐测试菌种金黄色葡萄球菌。本文以市面上常见的香皂产品为例，对香皂产品的除菌测试方法进行了探索，研究了试验菌种、洗脱条件对除菌效果的影响，最终建立了一种香皂产品除菌效果的测试评价方法，并使用该方法评价不同香皂产品的除菌效果。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

菌种（金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠埃希菌ATCC 8099），山西省疾病预防控制中心；无菌新鲜猪皮，自制；氯化钙（CaCl2）、六水合氯化镁（MgCl2·6H2O），无水磷酸氢二钠（Na2HPO4），磷酸二氢钾（KH2PO4），均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；吐温80，化学纯，天津科密欧化学试剂有限公司；营养琼脂（NA）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），北京陆桥技术股份有限公司。

高压蒸汽灭菌锅YXQ-50S11，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；WGZ-2XJ细菌浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；涡旋振荡器G560E，上海沪西分析仪器厂有限公司；生化培养箱LRH-250A，韶关市泰宏医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的准备

取第3～6代试验菌的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物，参照QB/T 2738—2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》制备菌悬液，用0.03mol/L PBS溶液将试验菌悬液稀释，通过浊度仪调节菌悬液浓度至(1.0～5.0)×108cfu/ml备用。

1.2.2 测试载体的处理

以无菌新鲜猪皮作为测试载体，新鲜猪皮预先经物理方法进行无菌处理（可采用钴-60辐射灭菌）。用无菌剪刀将猪皮裁剪至5 cm×5 cm，平铺于培养皿内，每两块猪皮为一组，擦干猪皮表面多余水分，在每块猪皮上接种0.10 ml菌悬液，使用一次性接种环将菌液涂抹均匀，避免接触猪皮边缘部位，于室温下静置20 min备用。将人工污染后的猪皮放入含60 ml PBS采样溶液的密封袋内中均匀搓揉皮肤1 min进行基线回收。

1.2.3 操作步骤

称取0.25 g的待测试样，置于一块猪皮的中央，再滴加1.00 ml无菌硬水，另取一块猪皮覆盖在试样上，固定底层的猪皮，手持摄子以中等力度揉搓上层猪皮15 s至试样完全溶解；待试样完全溶解并起泡后再以中等力度将两块皮沿上下左右的方向对搓30 s；用镊子夹住猪皮一端，左右移动猪皮，依靠水的自然下流冲洗15s，保持猪皮与水流的夹角约为120°，用无菌纸巾轻拍吸干猪皮上多余水分；清洗后的1 min内，将两块猪皮分别置于无菌密封袋内，加入60 ml的PBS采样溶液，均匀搓揉皮肤1 min。无菌操作回收密封袋内0.5 ml的洗脱液进行梯度稀释。以无菌硬水代替试样，重复上述操作作为空白对照组。采用标准细菌学检测技术，浇注TSA平板的方式对洗脱液中的活菌进行计数。

1.2.4 活菌计数

将试验组和空白对照组的平板倒置于（36±1）℃的生化培养箱，培养（48±4）h，计数菌落数。计算不同试样的相对除菌率。

式中：Ⅰ.空白对照组回收菌落数；Ⅱ.试验组回收菌落数。

1.3 可靠性评价

使用此方法对5种市售香皂的除菌效果进行评价，其中试样A、B、D为具有除菌宣传的香皂产品，试样C、E为普通型香皂产品，产品的配方信息见表1。对每个样品进行3次独立重复试验，每次试验中每个样品做3组平行。对比3次试验结果，通过每组数据的均值、标准偏差等指标评价该方法的重复性和区分度。

表1 不同香皂产品的配方信息

1.4 统计分析

所有试验数据均用Microsoft Office Excel进行数据录入，使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，对多组数据采用单因素方差分析（One Way ANOVA）检验方法进行比较，对多组数据间的两两比较通过等方差假设选项下的LSD方法进行比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 试验菌种的选择

国内日化行业抗抑菌相关行业标准中常见的推荐菌种有金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）和大肠埃希菌（ATCC 8099）分别作为革兰氏阳性代表菌和革兰氏阴性代表菌。分别以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为试验菌，测试了仅使用硬水清洗猪皮的除菌率；表2数据说明，对猪皮上金黄色葡萄球菌的水洗除菌率约为50%，表3数据说明，对猪皮上大肠埃希菌的水洗除菌率约为65%；仅通过清水冲洗只能除去载体表面的部分细菌，日常生活中仍需要使用具有除菌功效的洗涤产品，因此，本方法中香皂产品的除菌方法中以金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）作为革兰氏阳性菌的代表试验菌，以大肠埃希菌（ATCC 8099）作为革兰氏阴性菌的代表试验菌。

表2 以金黄色葡萄球菌作为试验菌时无菌硬水的除菌效果

表3 以大肠埃希菌作为试验菌时无菌硬水的除菌效果

2.2 试验载体的选择

体外模拟法的关键是需要找到一种可以替代人体皮肤的离体皮肤模型。在不同的动物皮肤中，猪的皮肤厚度与人体皮肤厚度相似，猪皮肤角质层含有与人体皮肤角质层相似的蛋白质成分，以及真皮层血管的数量、大小、分布都与人体皮肤相似，猪的体表面积大，可同时采集多个样本[7-8]，国外标准ASTM E289712中也推荐以离体猪皮作为载体进行试验。因此本方法中以无菌猪皮作为染菌载体，每两块猪皮为一组。试验前需要将猪皮裁剪至5 cm×5 cm，以便于将两块猪皮进行对搓。

2.3 菌悬液及待测试样的添加量

每块猪皮上试验菌悬液及待测试样的添加量参考标准ASTM E289712的附录进行计算，具体是根据在猪皮上的使用体积与临床研究中在手上的使用体积成比例进行估算。试验中所用的猪皮大小为5 cm×5 cm，已知男性的平均手表面积为1070cm2，女性的平均手表面积为890 cm2，男性和女性的近似平均值为980 cm2，ASTM E117413中推荐每位受试者手上使用4.50 ml的试验菌悬液，等价于每对猪皮上添加0.230 ml的试验菌悬液，结合实际情况，在每块5 cm×5 cm猪皮上添加0.10 ml的试验菌悬液时，刚好可以涂抹均匀而不会过量；ASTM E117413中推荐每位受试者手上使用5.00 ml的待测试样，等价于每对猪皮上添加0.255 ml的待测试样，结合实际情况，本方法中每对猪皮使用0.25 ml的待测试样。计算公式如下：Vh＝手上待测试样（或微生物悬浮液）的体积；Ap＝猪皮的表面积；Ah＝手的表面积。

2.4 洗脱方式

2.4.1 洗脱液成分

各标准中采用的洗脱液成分有所不同，《消毒技术规范》（2002年版） 2.1.8.8中以0.03 mol/L PBS作为洗脱液回收织物上的残留活菌；ASTM E117413中以含0.1%AEO9的0.03 mol/L PBS溶液作为通过人体试验法评价除菌洗手液除菌效果方法的洗脱液。本方法中对洗脱液的种类进行了研究，由表4数据可知，使用不同的洗脱液对染菌载体的洗脱效果有所不同，0.5%吐温80（PBS配制）的洗脱效果较差，洗脱率约为80%；0.03 mol/L PBS和0.3%卵磷脂+1%吐温80（PBS配制）的洗脱效果较好，洗脱率均在90%以上；0.3%卵磷脂+1%吐温80（PBS配制）的配制较PBS复杂，而这两种洗脱液对无菌猪皮的洗脱效果差别不大。因此本方法中以PBS作为洗脱液。

表4 洗脱液成分对猪皮洗脱效果的影响

2.4.2 洗脱液体积

为了研究洗脱液体积对洗脱效果的影响，分别使用40 ml、60 ml、80 ml、100 ml的洗脱液将细菌从人工污染的猪皮上洗脱。从表5中数据可以看出，当洗脱液体积为60ml时，洗脱下来的细菌含量最多，对于无菌猪皮上的细菌洗脱效果最好。当洗脱液体积较少时，无法完全浸没猪皮，洗脱不充分；当洗脱液体积较多时，可以完全浸没猪皮，但细菌在洗脱液中可能分布不够均匀，细菌回收率也较低，因此，本方法中以60ml作为回收人工污染后猪皮上细菌的洗脱液用量。

表5 洗脱液体积对猪皮洗脱效果的影响

2.4.3 洗脱时间

为了研究洗脱时间对洗脱效果的影响，分别测试了在30s、60s、90s、120s四个洗脱时间下对人工污染的猪皮上细菌的洗脱效果（表6）。图1可知，随着洗脱时间的增加，细菌回收率也越高，当洗脱时间为60s时，洗脱下来的细菌数达到拐点，再随着洗脱时间增加，回收菌数的增幅较小。因此本方法中将60s作为回收染菌猪皮上活菌数的洗脱时间。

图1 洗脱时间对猪皮洗脱效果的影响

表6 洗脱时间对猪皮洗脱效果的影响

2.5 不同试样的除菌效果

为了进一步验证使用该方法评价不同香皂产品除菌效果的重复性及区分度，随机选取5种市售香皂产品，分别以金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）和大肠埃希菌（ATCC 8099）作为试验菌，测试不同产品的相对除菌率，并对结果通过单因素方差分析检验方法进行比较。

以金黄色葡萄球菌作为试验菌时，表7为3种除菌香皂和2种普通香皂的三次重复试验的相对除菌率结果。数据表明，除菌香皂与普通香皂之间的相对除菌率差异具有统计学意义（P＜0.05）；且不同产品试验结果的重复性与除菌率的高低有关，除菌率越高，重复试验的方差值越小，试验结果的重复性越好。

表7 不同香皂产品对金黄色葡萄球菌的相对除菌率

在此基础上，进一步对3种除菌香皂和2种普通香皂两两之间的相对除菌率分布差异通过等方差假定选项下的LSD方法进行比较（表8），结果显示，在3种除菌香皂中，试样D-试样A、试样A-试样B的两两之间相对除菌率平均值差异不具有统计学意义（P＞0.05），试样D-试样B的两两之间相对除菌率平均值差异均具有统计学意义（P＜0.05），可见，不同产品配方中添加的除菌有效成分不同，会进一步影响产品的除菌效果；除菌香皂B-普通香皂C的两两之间相对除菌率平均值差异均具有统计学意义（P＜0.05），可见，产品配方中是否添加有效除菌成分，会影响产品的除菌效果；普通香皂C-普通香皂E的两两之间相对除菌率平均值差异均具有统计学意义（P＜0.05），可见，当产品配方中不含有效除菌成分时，其余成分对产品的除菌效果也具有一定的影响，但普通香皂的除菌效果均明显低于除菌型香皂，是否添加有效除菌成分仍是香皂产品除菌效果高低的主要影响因素。

表8 不同香皂产品对金黄色葡萄球菌的相对除菌率的两两比较

以大肠埃希菌作为试验菌时，表9为3种除菌香皂和2种普通香皂的三次重复试验的相对除菌率结果。数据表明，除菌香皂与普通香皂之间的相对除菌率差异具有统计学意义（P＜0.05）；且不同产品试验结果的重复性与除菌率的高低有关，除菌率越高，重复试验的方差值越小，试验结果的重复性越好。此外，与金黄色葡萄球菌作为试样菌相比，同一试样对大肠埃希菌的除菌效果均优于对金黄色葡萄球菌的除菌效果。

表9 不同香皂产品对大肠埃希菌的除菌量

在此基础上，进一步对3种除菌香皂和2种普通香皂两两之间的相对除菌率分布差异通过等方差假定选项下的LSD检验方法进行比较（表10），结果显示，在3种除菌香皂中，试样D-试样A的两两之间相对除菌率平均值差异不具有统计学意义（P＞0.05），试样D-试样B、试样A-试样B的两两之间相对除菌率平均值差异均具有统计学意义（P＜0.05），可见，不同产品配方中添加的有效除菌成分不同，会进一步影响产品的除菌效果；除菌香皂B-普通香皂C的两两之间相对除菌率平均值差异均具有统计学意义（P＜0.05），可见，产品配方中是否添加有效除菌成分，会影响产品的除菌效果；普通香皂C-普通香皂E的两两之间相对除菌率平均值差异均具有统计学意义（P＜0.05），可见，当产品配方中不含有效除菌成分时，其余成分对产品的除菌效果也具有一定的影响，但普通香皂的除菌效果均明显低于除菌型香皂，是否添加有效除菌成分仍是香皂产品除菌效果高低的主要影响因素。

表10 不同香皂产品对大肠埃希菌的相对除菌率的两两比较

3 结论

市面上的香皂产品多种多样，有不少产品都宣传其具有除菌效果，但是现有的国家和行业标准中尚未建立除菌性能的测试评价方法[4-5]。本研究中，通过对试验条件进行探索，确定了以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为试验菌，5 cm×5 cm的无菌猪皮作为载体，每两块为一组，试验中，每块猪皮上添加0.10 ml的试验菌悬液，待测试样的使用量为0.25 g，清洗过程结束后，将每块猪皮置于含60 ml PBS溶液的无菌密封袋内均匀揉搓60 s以回收猪皮表明的残留活菌，建立了一种香皂产品除菌效果的试验方法，用于评价香皂产品的除菌效果。

在此试验条件下，选取5种市售的香皂产品进行了三次重复试验，结果表明该除菌方法具有较好的重复性及区分度，同一试样对大肠埃希菌的除菌效果优于金黄色葡萄球菌，不同试样相对除菌率的重复性与除菌效果有关，除菌效果越好的试样，除菌率的重复性越高。此外，试验结果表明，除菌香皂试样A、B、D通过该方法测得相对除菌率均高于普通香皂试样C、E，香皂产品配方中是否添加有效除菌成分是产品除菌效果高低的主要影响因素，而配方中不同的除菌成分以及其余成分也会进一步影响产品的除菌效果。因此，此除菌方法可用于评价不同香皂产品的除菌效果，同时也可作为日化产品除菌行业标准的制定基础。