内标法测定动物肉中脂肪酸组成及含量

张春华　宝　华　张崇志　李胜利　特日格勒　金　鹿　萨初拉　王海明　毕力格巴图　孙海洲

内标法测定动物肉中脂肪酸组成及含量

张春华宝华张崇志李胜利特日格勒金鹿萨初拉王海明毕力格巴图孙海洲

（内蒙古自治区农牧业科学院内蒙古呼和浩特010031）

试验通过GC2030气相色谱仪，利用100 m长的SP-2560毛细管色谱柱，采用内标法定量定性分析山羊肉中脂肪酸组成及含量。结果显示，此方法简便、快捷，加入的内标C11与待测样品组分中的C11相似或相近时间出峰，线性范围好，相关系数达0.999 0以上，回收率为84.33%～91.66%，相对标准偏差（RSD）在5%左右。

内标法；气相色谱法；肉样脂肪酸；组成；含量

内蒙古是我国重要的畜牧业生产基地，盛产牛羊肉。随着生活水平的不断提高和膳食结构的改善，人们对肉质鲜嫩适口，富含人体所需蛋白质、不饱和脂肪酸和氨基酸的优质肉品需求越来越高。因此，研究者越来越关注畜产品的品质。本试验通过对山羊肉样品进行水解、脂肪提取、脂肪皂化和甲酯化，最后上机测定肉中脂肪酸组成及含量，为进一步研究肉、乳脂肪酸含量的测定提供有效方法和理论数据[1-2]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

试验仪器：岛津气相色谱仪（型号：GC2030）、FID检测器、全自动进样器、100 m×0.25 μm×0.2 nm的SP2560毛细管柱（赛默飞世尔公司提供）。

试验试剂：高纯氮气（N2，纯度99.99%）、37种脂肪酸混标（SIGMA公司提供）、水（符合GB/T 6682中规定的一级水）、无水乙醇色谱试剂、无水乙醚色谱试剂、盐酸、CH3OH（色谱纯）、正庚烷（色谱纯）、三氟化硼甲醇（色谱纯）、NaOH（分析纯）、NaCl、无水Na2SO4、C11内标（SIGMA公司提供）。

1.2 仪器条件

气相色谱仪采取程序升温法进行设置，初始温度100 ℃，保持5 min，以3 ℃/min的速度升温到240 ℃，保持35 min；进样口温度240 ℃，检测器温度240 ℃；载气为高纯N2；分流比值20∶1；每次自动进样1 μm。

1.3 样品的前处理

1.3.1 样品称取与水解

使用感量0.1 mg的天平称取山羊肉样品2 g或2 g以内放入平底烧瓶中，加入备好的内标2 mL，再加2 mL95%的乙醇，继续加配制浓度为8.3 mol/L的盐酸10 mL，混匀。将平底烧瓶放入85 ℃水浴锅内水浴40 min，其间振荡几次，之后室温冷却备用。

1.3.2 脂肪的提取

向水解好的备样中加入10 mL95%的乙醇，混匀。将平底烧瓶中的水解液全部转移到250 mL的分液漏斗中，再将100 mL乙醚和石油醚1∶1的混合液分3次倒入分液漏斗中，加盖，继续摇晃数次混匀。静置分层30 min后，弃去分液漏斗下层溶液，上层醚层经塞含无水Na2SO4棉花的大漏斗过滤后，转移至250 mL平底烧瓶中，再用30 mL乙醚和石油醚1∶1的混合液冲洗分液漏斗，再转移至平底烧瓶中。用旋转蒸发仪浓缩至干，平底烧瓶中剩下的残留物为脂肪提取物。

1.3.3 脂肪的皂化和甲酯化

向上步提取物中加入10 mL浓度为2%的氢氧化钠甲醇溶液，放入回流冷凝装置的水浴锅中，90 ℃水浴回流30 min。冷凝回流大概25 min时，从冷凝管上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液，再加2 mL甲醇，继续回流几分钟后取下回收瓶冷却。再加10 mL正庚烷，手摇振荡3 min～5 min，加饱和NaCl至瓶颈，放入超声仪中超声10 min后取出静放，等待分层。分层后，用装有无水Na2SO4的一次性注射器吸取上层正庚烷层液体1 mL左右，用滤膜将溶液过滤后放入样瓶中备用。

1.3.4 脂肪酸混标的配置

将37种脂肪酸标准品混标配制成4个不同浓度待测，分别为0.15 mg/mL、0.35 mg/mL、0.6 mg/mL和0.8 mg/mL。

1.3.5 试样中脂肪酸含量的计算

参照国家标准GB 5413.27—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》[3]，计算试样中的脂肪酸含量。

1.4 样品的回收率测定

已知含量的待测样中加入已配好的不同浓度的标准品溶液，继续上机检测，再计算回收率。回收率=（待测混合样测定值/原样浓度+标准品加入量）×100%。

2 结果与讨论

2.1 脂肪酸标准品谱图

将配制好的不同浓度的37种脂肪酸标准品混标上机后，根据每种脂肪酸甲酯气相色谱图的峰面积，以标准品色谱图出峰的保留时间为依据，对未知样品中测定出的脂肪酸进行定性，以碳十一烷酸（C11:0）内标峰面积定量分析未知样品中脂肪酸的相对含量。脂肪酸标准品的气相色谱图如图1。

2.2 标准曲线的制作

以配制好的37种脂肪酸标准品的不同浓度为轴，峰面积为轴，制作37条标准曲线，进行回归计算。图2为其中短链C4:0和长链C22:6n3的标准曲线图，回归方程分别为：=3E-06-0.005 9，2=0.999 5；=9E-07+0.001 1，2=0.999 3。

图2　脂肪酸标准品标准曲线图

2.3 回收率的测定

样品的回收率测定值如表1，从表1中数据可见，样品的回收率测定值均在84%以上。

表1样品的回收率测定值

组分原样浓度标准品加入量/mg/mL混合样实测值/mg/mL回收率/%`x±RSD%123123123 C11:00.010 10.008 00.004 00.002 00.017 00.012 70.010 293.7490.1584.1989.73±5.40 C12:00.020 60.016 00.008 00.004 00.034 40.026 10.020 993.9091.1785.0790.05±5.02 C13:00.010 40.008 00.004 00.002 00.017 40.013 40.010 794.7992.7986.6291.40±4.66 C14:00.021 10.016 00.008 00.004 00.035 10.026 60.022 394.6391.5088.8691.66±3.15 C14:10.010 10.008 00.004 00.002 00.016 70.013 00.010 492.2291.8585.9590.01±3.95 C15:00.010 60.008 00.004 00.002 00.017 50.013 50.010 994.2692.5186.3191.03±4.59 C15:10.010 40.008 00.004 00.002 00.017 60.013 40.010 795.6192.8685.9291.46±5.46 C16:00.027 40.016 00.008 00.004 00.038 90.031 10.026 089.5987.9582.8686.80±4.03 C16:10.010 00.008 00.004 00.002 00.016 90.012 90.010 393.9091.8185.9990.57±4.53 C17:00.009 50.008 00.004 00.002 00.015 70.011 80.009 689.8687.6783.3586.96±3.81

续表1样品的回收率测定值

组分原样浓度标准品加入量/mg/mL混合样实测值/mg/mL回收率/%`x±RSD%123123123 C18:00.018 10.016 00.008 00.004 00.030 80.023 20.018 590.2788.9583.5787.60±4.05 C18:1n9c0.018 20.016 00.008 00.004 00.031 00.023 10.018 690.7487.9883.7887.50±4.01 C18:2n6t0.010 50.008 00.004 00.002 00.017 50.013 30.010 694.7591.5584.8490.38±5.60 C18:2n6c0.009 30.008 00.004 00.002 00.015 60.011 50.009 590.1286.7583.9586.94±3.55 C20:00.018 70.016 00.008 00.004 00.031 70.023 80.019 091.4589.2483.7888.16±4.48 C18:3n60.009 50.008 00.004 00.002 00.015 80.011 90.009 690.5287.8783.2687.22±4.21 C20:10.009 40.008 00.004 00.002 00.015 80.011 90.009 690.9688.9383.9187.93±4.13 C21:00.010 00.008 00.004 00.002 00.016 30.012 40.010 090.4988.9182.9587.45±4.55 C20:20.009 60.008 00.004 00.002 00.015 80.012 00.009 789.8688.1883.2687.10±3.94 C22:00.018 80.016 00.008 00.004 00.031 50.023 60.019 190.5687.9483.7587.42±3.93 C22:1n90.009 40.008 00.004 00.002 00.015 60.011 80.009 589.8088.3983.5087.23±3.79 C20:3n60.009 00.008 00.004 00.002 00.015 10.011 30.009 088.5987.1881.9285.90±4.09 C22:20.009 40.008 00.004 00.002 00.015 70.011 60.009 589.9686.3983.3986.58±3.80 C24:00.018 70.016 00.008 00.004 00.031 60.023 80.019 191.0789.1584.2288.15±4.01 C20:5n30.010 00.008 00.004 00.002 00.016 90.012 80.010 393.8091.1185.5690.16±4.66 C24:10.009 60.008 00.004 00.002 00.016 00.012 00.009 690.9387.8983.0287.28±4.57 C22:6n30.010 00.008 00.004 00.002 00.016 30.012 50.010 290.7589.1484.6088.16±3.62

2.4 山羊肉中脂肪酸组成及含量

肉样脂肪酸组成及含量测定结果如表2。由表2可见，肉样中股二头肌、背最长肌、臂三头肌不同部位的脂肪酸含量差异不显著（>0.05）。总不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸（U/S）的比值范围为1.35～1.50，多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸（P/S）的比值范围为0.20～0.28，这与陈雪军等（2008）研究的月龄对湖羊脂肪酸的影响[4]结果一致。

表2肉样脂肪酸组成及含量测定结果

脂肪酸肉样 化学名分子式臂三头肌背最长肌股二头肌 十二碳酸C12:00.150.130.14 十四碳酸C14:01.231.671.33 顺-9-十四碳一烯酸C14:10.120.140.12 十五碳酸C15:00.350.470.28 顺-10-十五碳一烯酸C15:10.670.580.78 十六碳酸C16:020.1921.3719.95 顺-9-十六碳一烯酸C16:11.651.971.75 十七碳酸C17:00.901.181.11 十七碳一烯酸C17:10.821.050.97 十八碳酸C18:015.5516.1816.37 反-9-十八碳一烯酸C18:1n9t1.251.751.32 顺-9-十八碳一烯酸C18:1n9c47.0142.6442.58 反,反-9,12-十八碳二烯酸C18:2n6t0.100.060.08 顺,顺-9,12-十八碳二烯酸C18:2n6c3.474.145.56 顺,顺,顺-9,12,15-十八碳三烯酸C18:3n60.130.130.16 顺,顺,顺-6,9,12-十八碳三烯酸C18:3n31.181.471.76 二十碳酸C20:00.380.080.19 顺-11-二十碳一烯酸C20:10.150.120.14 顺,顺-11,14-二十碳二烯酸C20:20.130.070.09

续表2肉样脂肪酸组成及含量测定结果

脂肪酸肉样 化学名分子式臂三头肌背最长肌股二头肌 顺,顺,顺-8,11,14-二十碳三烯酸C20:3n60.230.240.33 顺,顺,顺-11,14,17-二十碳三烯酸C20:3n30.170.150.24 顺,顺,顺,顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸C20:4n61.171.281.37 全顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸C20:5n30.920.971.44 二十一碳酸C21:00.490.680.06 二十二碳酸C22:00.630.760.98 顺-13-二十二碳一烯酸C22:1n90.160.160.08 顺,顺-13,16-二十二碳二烯酸C22:20.090.070.08 全顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸C22:6n30.370.380.48 二十四碳酸C24:00.090.070.25 二十四碳一烯酸C24:10.090.040.09 单不饱和脂肪酸MUFA（%） 52.1648.4547.83 多不饱和脂肪酸PUFA（%） 8.128.9611.51 不饱和/饱和U/S（%） 1.501.351.46 多不饱和/饱和P/S（%） 0.200.210.28

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

2000年前后，37种脂肪酸的测定仪器也是气相色谱仪，但所使用的柱子有填充柱和石英柱[5-6]等。随着科学的发展和仪器设备的转型升级，以及气相色谱技术的迅猛发展，现在主要使用不同长度的毛细管柱来测定脂肪酸组成及含量。因为毛细管柱子长、柱效高，大大弥补了其他柱子分离能力较差的缺点，很容易分离结构复杂的混合物成分，尤其适用于脂肪酸同分异构体的分离。本试验采用以聚100%二氰丙基硅氧烷为固定相的SP-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm）毛细管色谱柱，每个脂肪酸分离出来的峰较清晰，效果较好。

3.2 内标法和外标法的比较

37种脂肪酸的测定有内标法和外标法两种。郑玉梅等（2002）测定奶油中c9，t11-共轭亚油酸含量时，是用十七烷酸甲酯为内标定量分析的[7]。张春华等（2012）采用外标法，利用GC2014气相色谱仪测定动物肉脂肪酸组成[8]。过去，用外标法测定脂肪酸是用面积归一化法来进行计算的，系统误差较大，而内标法的优点是较好地克服了实验过程中的系统误差。本研究是以C11为内标，采用内标法测定动物肉中脂肪酸的组成及含量，结果表明，第十碳以上的长链脂肪酸分离的线性范围好，相关系数达0.999 0以上，回收率为84.33%～91.66%，相对标准偏差在5%左右[9]。

4 结语

脂肪酸的甲酯化步骤及使用的药品有很多种[8]。下一步继续开展肉、乳脂肪酸测定试验时，有必要采用张春华等[8]（2012）的研究中提到的脂肪酸前处理中不同的甲酯化步骤做对比，比较测定结果，进一步筛选出脂肪酸甲酯化方法的优劣。

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[3]中国人民共和国卫生部.食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定:GB 5413.27—2010[S].北京:中国标准出版社,2010.

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.02.21

TS251.7

A

2095-1205(2022)02-66-04

2022年内蒙古自治区草食动物营养科学重点实验室项目（2022CXJJM14）；2020年内蒙古自然基金联合基金项目（2020LH03019）；2021年内蒙古自治区留学回区人员创新启动支持计划项目

张春华（1978- ），女，蒙古族，内蒙古通辽人，博士，副研究员，研究方向为反刍动物营养与饲料科学。

孙海洲（1971- ），男，蒙古族，内蒙古乌海人，博士，研究员、博士生导师，研究方向为反刍动物营养调控理论研究。