三种固相萃取柱在农产品高氯酸盐检测中应用比较

李冬桂，吕丽兰，陆覃昱，吴 凤，李慧敏，黄婵婵，陈羽烨，甘志勇

〔1广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁 530001；2农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（南宁），广西南宁 530001；3农业农村部亚热带果品蔬菜质量监督检验测试中心，广西南宁 530001〕

高氯酸盐是一种有毒的无机化学物质，其物理化学性质及其稳定，在环境中不易分解[1]。高氯酸盐水溶性高，在地下水和地表水中流动性强，可经水、土壤等途径被植物富集吸收，并通过食物链作用进入人体[2-3]。高氯酸盐在体内富集对人体健康造成神经毒性、生殖毒性和遗传毒性等方面危害[4]。随着经济和科技高速发展，高氯酸盐被广泛应用于航空业、军火工业、橡胶制品等领域[5]。高氯酸盐污染食品的情况在世界范围内普遍存在，蔬菜、牛奶及其制品、饮用水、茶叶、肉类等食品中都检出不同含量水平的高氯酸盐[6-7]。

目前，高氯酸盐分析方法主要有离子色谱法、离子色谱—质谱法、液相色谱—串联质谱法等[8-9]。液相色谱—串联质谱法具有抗基质干扰优异，检测灵敏度高，检出限低，仪器使用更为普及、方法优化前景更广阔等优点[10]。高氯酸盐的检测，较多采用该方法[11]。固相萃取净化柱可以降低质谱基质干扰，提高待测物检测的灵敏度。由于不同类型净化柱针对不同基质样品，净化效果和检测成本存在差异，根据喀斯玛商城（https://www.casmart.com.cn）查询，商品价格PRiME HLB 固相萃取柱＞石墨碳黑柱[12]＞C18固相萃取柱。我国对不同基质中高氯酸盐的检测标准仍不完善。SN/T 4089-2015《出口食品中高氯酸盐的测定液相色谱—质谱/质谱法》推荐使用净化柱为C18柱[13]，BJS201706《食品中氯酸盐和高氯酸盐的测定》推荐使用PRiME HLB 柱[14]，目前尚未有关于C18柱和HLB 柱针对蔬菜、水果和茶叶样品中高氯酸盐检测净化效果差异的相关文献报道，且现有标准没有蔬菜基质样品检测净化柱的推荐。拟研究采用液相色谱—串联质谱法考察HLB柱，C18柱和石墨碳黑柱三种净化柱在蔬菜、水果和茶叶检测中净化效果，筛选出适合蔬菜、水果和茶叶中高氯酸盐检测的固相萃取净化柱，为完善农产品中高氯酸盐检测标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

样品：蔬菜水果样品来自超市和农贸市场的随机取样，蔬菜包括叶菜类、芸薹属类、根茎类、鳞茎类、茄果瓜类、食用菌类、豆类，水果样品包括热带亚热带水果、仁果核果类，浆果类、柑橘类、瓜类等，茶叶样品购买于超市及茶叶销售商店，包括黑茶、红茶、绿茶、花茶。

仪器：LC-20ADXR 超高压液相色谱仪（日本岛津公司）；API3200 质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；KQ3200DE 超声震荡器（昆山市超声仪器有限公司）；旋涡混匀器（德国IKA 公司）；3K30 台式冷冻离心机（美国Sigma 公司）。

试剂耗材：乙腈、乙酸铵（色谱纯，美国Fisher 公司）；高氯酸根标准溶液（ClO-4，1000mg/L，美国Inorganic Ventures 公司）；高氯酸根内标溶液（Cl18O-4，100mg/L，美国 Cambridge Isotop Laborltories 公司）；C18固相萃取柱（500mg/6mL，Agilent 公 司）；PRiME HLB固相萃取柱（500mg/6cc，美国Waters 公司），石墨碳黑柱（500mg/6mL，Agilent 公司）。

1.2 溶液配制

准确移取高氯酸根及其内标标准溶液适量，以水逐级稀释分别配制为1mg/L 高氯酸根及其内标标准中间液，-20℃冰箱避光保存。用流动相乙腈-20mmol/L 乙酸铵溶液稀释中间液，配制系列浓度标准工作液为1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L，高氯酸根同位素内标液浓度为20 μg/L。配制高氯酸根及其内标标准混合液20 μg/L 作为对照溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

蔬菜、水果样品用组织捣碎机制成匀浆，茶叶样品用粉碎机粉碎，过40 目筛。准确称取匀浆好的蔬菜、水果样品5 g，粉碎的茶叶样品1 g（精确至0.001 g），置于50 mL 离心管中，加入1 mg/L 高氯酸根同位素内标中间液0.4 mL，加入超纯水7 mL，混匀。蔬菜、水果样品常温振荡超声5 min，茶叶样品60℃水浴振荡超声5 min，再加入13 mL 乙腈，混匀，进一步提取。蔬菜、水果样品常温振荡超声提取30 min，茶叶样品60℃水浴振荡超声提取30 min，提取后样品经10000 r/min 常温离心10 min，取上清液待净化。

1.3.2 净化

分别取5 mL 乙腈/ 水（V/V，13∶7）混合液过C18柱和石墨碳黑柱，重力洗脱活化，弃去洗脱液。当洗脱溶剂全部流出时，吸取离心后的样品上清液至净化柱内，采用重力过柱。HLB 柱不需活化，直接吸取样品上清液至净化柱内重力过柱，弃去前1 mL 流出液。收集各净化柱的续滤液，过0.22 μm 滤膜供UPLC-MS/MS 测定。

1.3.3 色谱条件

液相色谱条件：色谱柱Acclaim TRINITYP1复合离子交换柱（100 mm×2.1 mm，3 um），流动相乙腈（A）和20 mmol/L 乙酸铵，流速0.4 mL/min，柱温35℃，进样量5 μL，梯度洗脱条件：0～0.2 min，70%A，0.2～3 min，70%～90%A，3～7 min，90%A，7～8 min，90%～70%A，8 min～11 min，70%A。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），负离子多反应监测（MRM）扫描；电喷雾电压（IS）5500 V；离子源温度550℃；碰撞气Medium；气帘气压力（CUR）30.0 Psi；雾化气压力（Gas 1）55.0 Psi；辅助气（Gas 2）55.0 Psi。由于氯原子有两个同位素原子，因此高氯酸根有两个母离子，质谱参数见表1。

表1 高氯酸盐的质谱分析参数

1.3.4 三种固相萃取柱净化效果比较

在样品净化环节，从加标回收、色素干扰及色谱峰表现等方面对PRiME HLB、C18和石墨碳黑三种不同净化柱的净化效果进行考察择优。并用选出的净化柱对不同样品进行不同添加水平的回收试验及对实际样品进行检测，检验适用性。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 软件进行数据分析。

2 结果分析与讨论

2.1 三种固相萃取柱对加标样品绝对回收率比较

选择空白基质样品，蔬菜以生菜、白菜、萝卜、荷兰豆为样品，水果以柑橘、香蕉、梨、葡萄为样品，茶叶以红茶、茉莉花茶、绿茶、六堡茶为样品。欧盟2020 年设定蔬菜、水果中高氯酸盐限量值为0.05 mg/kg，茶叶为0.75 mg/kg。以欧盟对高氯酸盐限量值为参考，选一个适合浓度添加水平，考察三种固相萃取柱绝对回收率。水果、蔬菜样品中高氯酸根及其18O 标记高氯酸根添加水平均为80 μg/kg，茶叶样品中高氯酸根及其18O 标记高氯酸根添加水平均为400 μg/kg，按照1.2.2 方法进行提取，并分别经PRiME HLB、C18和石墨碳黑三种净化柱净化，考察三种净化柱对高氯酸盐及其内标的绝对回收率影响，结果见表2。经过HLB 柱和C18柱净化的样品，高氯酸盐及其内标绝对回收率相差不大，石墨碳黑柱处理的样品，绝对回收率最低。

表2 不同基质加标样品过固相萃取柱后高氯酸盐及其内标绝对回收率

HLB 柱采用水浸润性聚合物吸附剂，不需活化和平衡，可直接使用，可以去除盐类、蛋白质、脂肪和磷脂等常见基质。C18柱是在硅胶表面键合十八烷基，可以去除色素、盐、大分子等干扰物。石墨碳黑柱填充材料为石墨化碳颗粒，既可以吸附非极性和弱极性的化合物又可以吸附极性化合物，对化合物表现出很广的吸附性。石墨碳黑柱处理的样品，高氯酸盐及其内标绝对回收率最低，可能是因为石墨碳黑柱吸附能力较强，对高氯酸盐及其内标物有吸附。因此选择HLB 柱和C18柱净化样品较适合。

2.2 三种固相萃取柱对加标样品色素干扰

比较PRiME HLB、C18和石墨碳黑三种净化柱除色素情况。石墨碳黑柱虽然能较好的吸附样品中色素，但过净化柱后，高氯酸盐及其内标绝对回收率最低。HLB 柱、C18柱对蔬菜、茶叶样品色素的去除能力相当，对部分水果样品，HLB 柱去除色素能力优于C18柱，如葡萄样品，净化后效果见图1，HLB 柱净化后样品比C18柱净化后澄清。因此，水果样品适用于HLB 柱，蔬菜、茶叶样品适用于HLB 柱和C18柱。

图1 经HLB 柱、C18 柱和石墨碳黑柱净化后样液效果比较

2.3 三种固相萃取柱对加标样品净化后的色谱图

选择空白基质样品，考察了PRiME HLB，C18和石墨碳黑三种净化柱对80 μg/kg 蔬菜、水果加标样品，400 μg/kg 茶叶加标样品提取液的净化效果，高氯酸盐的峰面积信号响应值见表3。三种固相萃取柱净化后的加标样品色谱图见图2、图3、图4 所示，净化后色谱图峰形尖锐对称。蔬菜、水果样品均为过HLB 柱净化后高氯酸盐峰面积响应最大，石墨碳黑柱最小。且HLB 柱与C18柱相比不用活化，节省试剂和时间。因此，蔬菜、水果样品选择HLB柱做为净化柱。

图2 三种固相萃取柱净化茶叶加标样品后高氯酸盐及其内标色谱图

图3 三种固相萃取柱净化水果加标样品后高氯酸盐及其内标色谱图

图4 三种固相萃取柱净化蔬菜加标样品后高氯酸盐及其内标色谱图

表3 不同加标样品经过不同净化柱后高氯酸盐响应值

茶叶样品过HLB 柱和C18柱净化后峰面积响应值差不多，石墨碳黑柱最小。由于茶叶样品经HLB柱和C18柱净化后均能获得较好的绝对回收率，均适用茶叶样品，但HLB 柱价格比C18柱贵[12]，因此茶叶样品选择C18柱净化。

2.4 样品加标过固相萃取柱的回收率影响

选择空白基质样品、生菜、黄瓜、金针菇、香梨和茶叶6 个样品，添加高、中、低3 个浓度的高氯酸盐，按照1.3.1 前处理方法处理样品，进行加标回收率实验。其中蔬菜、水果用HLB 柱净化、茶叶用C18柱净化，每个浓度平行测定6 次，结果如表4所示。添加回收率平均值为89.25%～117.4%，RSD为0.59%～2.94%。说明HLB 柱满足蔬菜、水果中高氯酸盐的检测要求，C18柱满足茶叶中高氯酸盐的检测要求。

表4 6 种样品加标过固相萃取柱回收率试验结果（n=6）

2.5 实际样品检测

取市售蔬菜、水果和茶叶样品各10 份，按照1.3.1 前处理方法处理样品。蔬菜、水果用HLB 柱净化、茶叶用C18柱净化，市售样品检测结果见表5所示。蔬菜中高氯酸盐平均值为23.3 μg/kg，检出率为90%，水果中高氯酸盐平均值为1.35 μg/kg，检出率为40%，茶叶中高氯酸盐平均值为398.93μg/kg，检出率为90%，说明蔬菜、水果和茶叶均受高氯酸盐污染。

表5 市售样品的高氯酸盐检测结果

3 结论

本文通过采用超高效液相色谱串联质谱仪进行测定，对农产品中内标法检测高氯酸盐适用固相萃取柱进行考察。通过比较HLB 柱、C18柱和石墨碳黑柱对蔬菜、水果和茶叶中高氯酸盐及其18O 标记高氯酸根同位素内标物检测的影响，确定了HLB 柱为蔬菜、水果中高氯酸盐检测净化柱，C18柱为茶叶中高氯酸盐检测净化柱。方法具有回收率高、操作简单、价格实惠等优点，为完善农产品中高氯酸盐检测标准提供参考依据。