玉米肽对小鼠酒精性脑损伤的保护作用及其机制

林 巍，曲国强，刘晓兰，任 健

(齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔161006)

随着我国经济的高速发展，酒类产量和消费量逐年增高，酒精性脑病的发病率呈逐年增长趋势，饮酒导致的脑损伤不仅严重影响人体身心健康，而且对社会也造成严重危害[1]。长期过量饮酒是脑损伤、脑血管病的主要病因，也是诱发脑血管病突发(如脑梗死)及老年痴呆的重要危险因素[2]。目前，有关酒精性脑病的临床治疗主要采取戒酒、营养支持和对症治疗等综合疗法，其目的就是减轻酒精性脑病临床症状，阻止酒精性脑病的进一步发展。由于目前慢性酒精中毒所致脑损伤缺乏有效的治疗，因而预防酒精中毒对脑组织的损伤至关重要。所以研究开发拮抗酒精性脑损伤的天然保健食品是目前医学和食品科学领域共同关注的热点。

玉米蛋白多肽链中存在多个功能区，经过蛋白酶控制性酶解之后，生理活性得到显著释放。目前已发现玉米蛋白水解物具有醒酒保肝、降血压、抗疲劳、抗氧化等多种活性[3-5]。其中玉米肽的醒酒活性研究最早，Yamaguchi等[6-8]率先报道了玉米肽具有促进乙醇代谢的醒酒作用。国内众多学者也分别制备出具有体外激活乙醇脱氢酶活性的玉米肽[9-12]；体内实验的研究主要集中在玉米肽的解酒效果以及玉米肽对酒精性肝损伤的保护作用[13-15]，而忽视了中枢神经系统毒性。本实验室研制开发的玉米肽不仅具有醒酒作用，并且能够减轻酒精对神经系统的刺激，缓解醉酒后头痛。但是玉米肽如何降低酒精对脑组织的损伤作用，如何改善酒后头痛的机制尚未清楚。本研究在前期研究的基础上，进一步探讨玉米肽对慢性酒精性脑损伤小鼠脑组织氧化应激水平及促炎细胞因子的调节作用，以期找到玉米肽改善酒精性脑损伤的客观依据，从而对长期大量饮酒的人群采取相应的保护措施，为预防脑损伤的天然保健食品的研究开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级ICR小鼠((18±2)g，实验动物生产许可证号SCXK(吉)2015—0005)，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司；玉米肽粉(蛋白质含量45.3%，其余为淀粉，肽分子质量<1 kDa)，依据发明专利ZL 201910249682.2实验室自制；基础鼠粮，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司；活性氧簇(ROS)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、γ干扰素(IFN-γ)、转化生长因子β1(TGF-β1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性和核因子κB(NF-κB)试剂盒，购于上海江莱生物科技有限公司；总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

MT70挤压膨化机，济南美腾机械设备有限公司；EnSpire全波长多功能酶标仪，美国珀金埃尔默公司；CF15RXII型高速低温离心机，日本日立公司；1X73倒置荧光显微镜，奥林巴斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养与分组

加肽鼠粮的制作：以1 g/kg中剂量玉米肽为例说明添加玉米肽鼠粮的制作。首先，用粉碎机将基础鼠粮粉碎，之后将玉米肽与粉碎后的基础鼠粮以质量比1∶1 000用搅拌机混合均匀，最后将混合后的饲料利用挤压膨化机制作成具有一定硬度的圆柱体饲料。高剂量玉米肽和低剂量玉米肽的制作，除质量比分别为2∶1 000和0.5∶1 000之外，其余过程均与中剂量玉米肽的制作过程一致。

ICR小鼠80只(雌雄各半)，随机分为5组，每组16只，分别为正常对照组、慢性酒精性脑损伤模型组(酒精模型组)、玉米肽高剂量组(2 g/kg)、玉米肽中剂量组(1 g/kg)、玉米肽低剂量组(0.5 g/kg)。慢性酒精性脑损伤模型建立参考 Turchan等[16]方法。将小鼠适应性饲养1周后，正常对照组饮用蒸馏水，饲喂基础鼠粮；给酒精模型组小鼠依次饮用体积分数为6%、12%、15%、20%的酒精溶液，饲喂基础鼠粮，其中体积分数为6%、12%、15%的酒精溶液分别饮用1周，体积分数为20%的酒精溶液一直饮用到实验结束；玉米肽实验组按分组分别饲喂加肽鼠粮，饮用酒精溶液同酒精模型组。各组小鼠皆自由摄食，实验周期为5个月。实验结束后，小鼠颈椎脱臼处死，取脑组织，一半用于病理组织学观察，一半用于脑组织中各项指标的测定。

1.2.2 脑组织的病理组织学观察

小鼠脱臼处死后，取出脑组织，留取双侧大脑半球，福尔马林固定，制成 HE染色切片并做病理组织学观察。

1.2.3 脑组织中氧化应激相关指标的测定

小鼠脱臼处死后迅速取脑组织，称重，加入一定量的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2～8℃。加入一定量的PBS，用匀浆器将标本充分匀浆。用低温离心机以2 000 r/min离心20 min。仔细收集上清，分装待检测。按试剂盒说明书进行脑组织中ROS、MDA、GSH含量和GST、GSH-Px、T-SOD活性的测定。

1.2.4 脑组织中促炎细胞因子含量的测定

脑组织处理同1.2.3，按试剂盒说明书进行IFN-γ、IL-6、TGF-β1、TNF-α含量的测定。

1.2.5 脑组织中凋亡相关指标的测定

脑组织处理同1.2.3，按试剂盒说明书进行Caspase-3活性和NF-κB含量的测定。

1.2.6 数据处理

应用SPSS19.0软件进行数据处理，各组数据结果以“平均值±标准差”表示，采用Duncan’s多重比较法进行显著性检验。P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 玉米肽对小鼠酒后脑组织病理组织学的影响(见图1)

由图1可知，与正常对照组小鼠脑组织相比，酒精模型组小鼠脑组织病理切片可见软脑膜充血(100倍可见，未展示)，神经细胞数量减少，锥体神经细胞固缩、染色加深，神经胶质细胞数量增多。玉米肽低剂量组软脑膜充血略减轻，神经细胞和神经胶质细胞病变也显著减轻。玉米肽中剂量组软脑膜充血明显减轻，但仍可见一定的神经细胞固缩和部分神经细胞溶解，神经胶质细胞增生减轻。玉米肽高剂量组软脑膜充血，可见明显的神经细胞固缩和部分神经细胞溶解，神经胶质细胞增生减轻。3个剂量组的玉米肽对酒精引起的脑损伤有不同程度的减轻作用。

图1 小鼠脑组织病理组织学观察结果(400×)

2.2 玉米肽对小鼠酒后脑组织中氧化应激相关指标的影响

2.2.1 玉米肽对小鼠酒后脑组织中ROS含量的影响(见图2)

注：不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)。下同

由图2可见：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中ROS含量显著升高(P<0.05)，表明酒精可引起氧化应激，增加小鼠酒后脑组织细胞中ROS含量；与酒精模型组相比，玉米肽低、中、高剂量组中ROS含量显著降低(P<0.05)，表明玉米肽可降低小鼠酒后神经细胞中ROS含量，减轻酒精导致的氧化应激。

2.2.2 玉米肽对小鼠酒后脑组织中MDA含量的影响(见图3)

图3 玉米肽对小鼠酒后脑组织中MDA含量的影响

由图3可知：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中MDA含量显著增加(P<0.05)，表明酒精摄入增加了脂质过氧化产物MDA的形成；与酒精模型组相比，玉米肽中、高剂量组中MDA含量皆显著减少(P<0.05)，其中高剂量组恢复到正常对照组水平(P>0.05)，表明玉米肽可以减轻酒精及其代谢物乙醛导致的脂质过氧化。

2.2.3 玉米肽对小鼠酒后脑组织中GSH、GSH-Px及GST水平的影响(见图4)

图4 玉米肽对小鼠酒后脑组织中GSH、GSH-Px及GST水平的影响

由图4可见：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中GSH含量显著减少，GST和GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；与酒精模型组相比，玉米肽中、高剂量组GSH含量显著增加(P<0.05)，玉米肽中剂量组GSH-Px活性显著增加(P<0.05)，玉米肽低、中、高剂量组GST活性皆显著提高(P<0.05)。这表明玉米肽可通过提高脑组织中GSH的含量，恢复GST和GSH-Px活性，缓解酒精及其代谢物对神经细胞的氧化应激和自由基损伤作用。

2.2.4 玉米肽对小鼠酒后脑组织中T-SOD活性的影响(见图5)

由图5可知：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中T-SOD活性显著降低(P<0.05)；与酒精模型组相比，玉米肽中、高剂量组中T-SOD活性显著提高(P<0.05)。小鼠酒后T-SOD水平降低可能与其被氧化自由基大量消耗有关，同时脂质过氧化物可抑制T-SOD活性，玉米肽能通过自身较强的抗氧化活性抑制脂质过氧化，从而缓解乙醇导致的T-SOD活性下降，提高细胞的抗氧化能力，减轻自由基对神经细胞的损伤。

图5 玉米肽对小鼠酒后脑组织中T-SOD活性的影响

2.3 玉米肽对小鼠酒后脑组织中促炎细胞因子含量的影响

2.3.1 玉米肽对小鼠酒后脑组织中IL-6含量的影响(见图6)

图6 玉米肽对小鼠酒后脑组织中IL-6含量的影响

由图6可见：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中IL-6含量显著升高(P<0.05)；与酒精模型组相比，玉米肽中、高剂量组IL-6含量显著降低(P<0.05)，其中玉米肽高剂量组与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。

2.3.2 玉米肽对小鼠酒后脑组织中TGF-β1含量的影响(见图7)

图7 玉米肽对小鼠酒后脑组织中TGF-β1含量的影响

由图7可见：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中TGF-β1含量显著升高(P<0.05)；与酒精模型组相比，玉米肽低、中、高剂量组TGF-β1含量显著降低(P<0.05)，但未恢复到正常对照组水平。

2.3.3 玉米肽对小鼠酒后脑组织中IFN-γ含量的影响(见图8)

图8 玉米肽对小鼠酒后脑组织中IFN-γ含量的影响

由图8可知：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中IFN-γ含量显著升高(P<0.05)；与酒精模型组相比，玉米肽低剂量组没有显著变化，但玉米肽中、高剂量组IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，恢复到正常对照组水平(P>0.05)。

2.3.4 玉米肽对小鼠酒后脑组织中TNF-α含量的影响(见图9)

图9 玉米肽对小鼠酒后脑组织中TNF-α含量的影响

由图9可见：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中TNF-α含量显著升高(P<0.05)；与酒精模型组相比，玉米肽低、中、高剂量组中TNF-α含量显著降低(P<0.05)，其中高剂量组恢复到正常对照组水平(P>0.05)。

2.4 玉米肽对小鼠酒后脑组织中凋亡相关指标的影响

2.4.1 玉米肽对小鼠酒后脑组织中Caspase-3活性的影响(见图10)

由图10可见：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中Caspase-3活性显著升高(P<0.05)，表明细胞凋亡途径在酒精诱导的认知缺陷中发挥作用；与酒精模型组相比，玉米肽低、中、高剂量组中Caspase-3活性未见显著改变(P>0.05)，表明玉米肽对酒精诱导的Caspase-3表达没有调节作用。

2.4.2 玉米肽对小鼠酒后脑组织中NF-κB含量的影响(见图11)

图11 玉米肽对小鼠酒后脑组织中NF-κB含量的影响

由图11可见：与正常对照组相比，酒精模型组小鼠脑组织中NF-κB含量显著升高(P<0.05)；与酒精模型组相比，玉米肽低、中剂量组NF-κB含量未见显著改变，但玉米肽高剂量组NF-κB含量显著降低(P<0.05)。这表明高剂量的玉米肽对酒后NF-κB含量具有一定的调节作用，可以通过抑制NF-κB表达，从而降低多种促炎因子的生成，减轻酒后脑组织炎症反应，缓解酒精对脑组织的损伤作用。

3 结 论

玉米肽对小鼠酒精性脑损伤具有显著的改善作用，能够提高脑组织中GSH含量，增加GST、GSH-Px和T-SOD活性，降低MDA含量，减少神经细胞中ROS含量；同时玉米肽还能够显著降低脑组织中TNF-α、IL-6、IFN-γ、TGF-β1和NF-κB水平。由此可知玉米肽不仅可调节酒精引起的神经细胞氧化应激，而且还通过下调促炎细胞因子水平从而改善慢性酒精性脑损伤，提示饮酒前食用玉米肽制品，可以减轻酒精对大脑的毒性作用。但是本研究对玉米肽保护脑组织的具体分子机理尚不清楚，还有待进一步深入研究。