红甜菜多糖提取条件优化的研究

郭庆晖，张琨霖，司茜媛，赵娇娇，张静，刘欢欢,3，李贞景,3

（1.天津市活力源饮料有限公司，天津 300000；2.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；3.省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457）

0 引言

红甜菜是藜科甜菜属二年生草本植物，其叶片小，叶柄、叶脉和块根均为红色[1]，俗称紫菜头[2]。大约在公元前5 世纪，甜菜由阿拉伯人通过丝绸之路从波斯传入中国，至今已种植2 500 多年。1986年红甜菜首次引入东北地区，目前在中国东北、华北及山东等地种植。

红甜菜营养丰富，其膳食纤维具有减肥、预防糖尿病、促进消化、降低胆固醇、预防心脑血管疾病等功能[3]，甜菜多糖对肿瘤细胞均具有一定的体外抑制作用[4]。经常食用，可显著增加血红蛋白量，改善贫血，增强血液携氧能力，增加免疫力、预防骨质疏松和甲状腺肿[5-6]。红甜菜中还含有皂苷、甜菜碱和甜菜色素等一些功能性成分[7]。红甜菜中所含的大部分糖很容易被人体消化和吸收。其中，膳食纤维能促进胃肠蠕动，促进矿物质如锌和铁的吸收，帮助人体排泄废物和减少毒素在身体内积聚[8]。2003年，红甜菜被世界卫生组织评选为13 种最佳蔬菜之一[9]。红甜菜提取物在食品、医药和化妆品等行业用于抗菌作用[10]。多糖是天然高分子化合物，其由单糖聚合而成且广泛存在于植物、动物和微生物组织中[11]。其中，植物多糖是由许多相同或不同的具有α-或β-糖苷键的单糖组成的在天然植物界普遍存在的化合物。大多数植物多糖不溶于冷水，并且在热水中呈粘液形态，具有构成生命活动、维持生命功能的作用。甜菜多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖和抗凝血作用[12]。因此，对甜菜多糖的研究越来越引起人们的关注。

水提醇沉法是利用多糖易溶解于水，但是在高浓度乙醇中难以溶解的性质，把多糖提取出来的方法[13]。此方法广泛应用于植物多糖的提取分离。水提醇沉法一般分为冷水提取、热水提取、酸水提取和碱水提取4种方法。其中热水提取法以环保、低毒、操作简单、对设备参数要求不高等特点成为提取多糖的最常用方法[14]。目前，红甜菜在国内外广泛栽培，然而，对甜菜的应用主要以传统的食品加工业为主，尚未对其进行科技含量更高的开发利用，造成一定的资源浪费[15]。因此，研究红甜菜多糖的提取方法对于开发红甜菜资源具有重要意义。本试验对红甜菜多糖的提取工艺进行优化，以获得最优工艺条件，为红甜菜多糖的进一步研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试品种与试剂

红甜菜品种为‘甜研红1号’，天津市活力源饮料有限公司提供。供试试剂：无水乙醇、苯酚、硫酸、磷酸（天津市江天化工技术有限公司）；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶、牛血清蛋白、葡萄糖、考马斯亮蓝G-250（北京索莱宝科技有限公司）；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BJ-800A 型多功能粉碎机，拜杰公司；PB-10 型pH 计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；AX622ZH/E型电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；SQP型电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FD-10型冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司；RE-2000A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TDZ5-WS型低速多管架自动平衡离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将切碎、烘干的红甜菜用多功能粉碎机粉碎后，过80目筛，筛下物装入自封袋，放入干燥器中备用。

1.3.2 单因素试验

（1）最佳料液比试验：称取20 g 甜菜根粉末，单因素试验每个处理组重复3次，分别按照料液比（g/mL）为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在温度为80 ℃，时间为1.5 h，不断搅拌的条件下进行热水提取，提取次数为3次，4 000 r/min离心20 min，合并滤液，测定多糖含量，计算提取率。

（2）最佳提取温度试验：称取20 g 甜菜根粉末，按照料液比（g/mL）为1∶30，分别在温度为20、40、60、80、100 ℃，时间为1.5 h，不断搅拌的条件下进行热水提取，提取次数为3 次，4 000 r/min 离心20 min，合并滤液，测定多糖含量，计算提取率。

（3）最佳提取时间试验：称取20 g 甜菜根粉末，按照料液比（g/mL）为1∶30，分别在时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，温度为80 ℃，不断搅拌的条件下进行热水提取，提取次数为3 次，4 000 r/min 离心20 min，合并滤液，测定多糖含量，计算提取率。

（4）最佳提取次数试验：称取20 g 甜菜根粉末，按照料液比（g/mL）为1∶30，在温度为80 ℃，时间为1.5 h，不断搅拌的条件下进行热水提取，分别提取1、2、3、4、5次，4 000 r/min离心20 min，合并滤液，测定多糖含量，计算提取率。

1.3.3 正交试验

依照参考文献[16]，以上述单因素试验为基础，选择料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）为试验考察因素，以红甜菜多糖提取率为评价指标，通过正交试验，每个处理组重复3次，探索红甜菜多糖提取的最优工艺条件。正交试验因素和水平如表1所示。

表1 正交试验因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.4 最佳除蛋白方法的考察

取500 mg 粗多糖，加入15 mL 蒸馏水充分溶解，调节pH=7，分别加入1.5%胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶，酶解时间为3 h，酶解温度为50 ℃，反应结束后沸水浴10 min，冷却至室温，4 000 r/min离心20 min除去沉淀，测定上清液中蛋白含量和多糖含量，筛选出最佳除蛋白方法。

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[17]。蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250比色法[18]。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据的整理、分析和作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验的结果

2.1.1 料液比对红甜菜多糖提取率的影响

料液比是影响多糖提取率的一个重要因素[19]。如图1A 所示，随着料液比增加，多糖提取率也增加，当液料比增至1∶30（g/mL）时，多糖提取率达到最高值。继续加大料液比，多糖提取率反而出现下降。当料液比为1∶20、1∶30、1∶40时，多糖提取率无显著差异，分别比液料比1∶50的多糖提取率增加7.57、11.05、10.90个百分点，因此，选择料液比为1∶30（g/mL），较为适宜。

图1 料液比（A）和提取温度（B）对红甜菜多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio(A)and extraction temperature(B)on extraction rate of polysaccharide from red beet

2.1.2 提取温度对红甜菜多糖提取率的影响

由图1B可知，红甜菜多糖提取率随着提取温度的升高而增加，当提取温度为80 ℃时，多糖提取率最大。当提取温度高于80 ℃时，多糖提取率开始出现降低。提取温度为40、60、80、100 ℃的多糖提取率分别比20 ℃时的多糖提取率增加5.68、20.76、29.06、22.55个百分点。当提取温度为60、80、100 ℃时，多糖提取率无显著差异。因此，选择提取温度为80℃，较为适宜。

2.1.3 提取时间对红甜菜多糖提取率的影响

由图2A 可知，红甜菜多糖提取率随提取时间的增长而增加，当提取时间为1.5 h 时，多糖提取率最大。提取时间多于1.5 h时多糖提取率呈下降趋势。提取时间为1.0、1.5、2.0、2.5 h时的多糖提取率分别比0.5 h时增加10.54、28.76、20.25、19.45 个百分点。当提取时间为1.5、2.0、2.5 h 时，多糖提取率无显著差异。因此，选择提取时间为1.5 h，较为适宜。

2.1.4 提取次数对红甜菜多糖提取率的影响

由图2B可知，随着提取次数的增加，红甜菜多糖提取率呈增加趋势。提取次数为2、3、4、5次时，多糖提取率分别比提取次数1 次时增加5.45、18.86、17.80、17.48 个百分点。当提取次数为3、4、5 次时，多糖提取率无显著差异。考虑经济因素，选择提取次数为3次，较为适宜。

图2 提取时间（A）和提取次数（B）对红甜菜多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time(A)and extraction times(B)on extraction rate of polysaccharide from red beet

2.2 优化试验

2.2.1 正交试验

上述单因素试验确定了正交试验的因素和水平，以多糖提取率为指标，进行L9（33）正交试验。由极差分析结果可知（表2），影响多糖提取率的因素主次顺序为料液比（A）＞提取时间（C）＞提取温度（B），最优水平组合为A3B2C2，即料液比（g/mL）为1∶40，提取温度为80 ℃，提取时间为1.5 h。

表2 正交试验极差结果Table 2 Range of orthogonal test results

2.2.2 验证试验

由于最优组合A3B2C2未出现在正交表中，因此与正交表中的最高得分组A3B1C3进行验证试验。验证试验结果A3B2C2的多糖提取率38.92%高于A3B1C3的多糖提取率38.09%，证明A3B2C2为最优组合。

2.3 除蛋白质方法的考察结果

如表3所示，在其他条件相同的情况下，分别加入不同的蛋白酶，其除蛋白效果不尽相同。其中，胰蛋白酶的蛋白脱除率较其他4种蛋白酶最高，且多糖的损失率最小。方差分析显示，胰蛋白酶的蛋白质脱除率与风味蛋白酶无显著性差异，与木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶有显著性差异；胰蛋白酶的多糖损失率与风味蛋白酶、复合蛋白酶无显著性差异，与木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶有显著性差异。综合分析后得，采用胰蛋白酶解法除蛋白的效果最好，蛋白质洗脱率为42.32%，多糖损失率为0.63%，比复合蛋白酶蛋白质洗脱率增加20.42个百分点，比碱性蛋白酶多糖损失率降低10.35个百分点。

表3 各种蛋白酶除蛋白质效果比较Table 3 Comparison of deproteinization effect of variousproteases

3 讨论与结论

料液比、提取温度、提取时间是影响多糖提取率的主要因素。本试验研究表明，影响多糖提取率的因素主次顺序为料液比＞提取时间＞提取温度。料液比是影响多糖提取率的最主要因素。其作用机理可能是随着溶剂量的增加，体系的扩散压也随之增大，促进了多糖分子向体系外围扩散，有利于多糖的提取，使得提取率上升并达到平衡状态；而溶剂量过大，杂质分子也被溶出，挤占多糖分子的空间，造成提取率下降。这一结果与杨申明等[20]的研究结果较为一致。多糖提取率也与提取温度有关，研究表明，一定范围内，多糖的溶解度随着温度的升高而增加。当提取温度高于80 ℃时，多糖分子间的氢键因高温而被破坏，造成糖链断裂，多糖水解成单糖和寡糖，导致多糖提取率降低[21]。此外，多糖提取率的下降也可能与多糖因加热时间过长而被降解有关[22]。

本试验联合采用单因素试验和正交试验，分析了料液比、提取温度、提取时间和提取次数关键工艺因素对多糖提取率的影响，最终确定了红甜菜多糖提取的最优工艺条件，即料液比（g/mL）为1∶40，提取温度为80 ℃，提取时间为1.5 h，提取次数为3次。在该工艺条件下，红甜菜多糖的提取率为38.92%。同时比较不同蛋白酶除蛋白的效果，发现胰蛋白酶解法除蛋白的效果最好。

本试验所优化的红甜菜多糖提取方法操作简单，可重复性好，准确性高，适合红甜菜多糖的提取，并为红甜菜多糖的进一步研究提供了依据。