不同单味中草药与其复配组方对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果

2022-04-06张浩然刘琴琴徐杭忠王婷婷

贵州农业科学 2022年3期

张浩然，刘琴琴，徐杭忠，王婷婷，唐毅*

(1.西南大学水产学院/水产科学重庆市重点实验室，重庆 400715；2.淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400715)

0 引言

【研究意义】嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)隶属弧菌科、气单胞菌属，是常见的革兰氏阴性短杆菌之一，为人-兽-鱼共患病病原，广泛分布于自然界各种水环境中，该菌能引起软体动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物全身性败血症或局部感染[1-6]。目前，抗生素仍是防治养殖鱼类嗜水气单胞菌感染的有效药剂，然而长期使用抗生素会产生较多问题：一是病原菌对抗生素产生耐药性，导致治疗效果变差[7]；二是杀灭鱼体内原有的益生菌，影响鱼体内环境微生态平衡；三是药物残留[8]，进而影响人体健康。弄清常见抑菌中草药单剂与复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果，对生产应用具有重要意义。【前人研究进展】中草药具有调节养殖动物机体免疫力、杀灭或抑制细菌和病毒等作用，并因其低毒、低残留、不易产生耐药性等特点越来越受到重视。柯文杰等[9]报道了25种中草药对普通变形杆菌的体外抑菌效果。吴颖瑞等[10]研究了153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性。丁瑞[11]报道了中药抗病原微生物作用的现代研究进展。夏与晴等[12]研究了25种中草药及其联合用药配伍对5种水产养殖常见致病菌的抑菌作用。周梦等[13]报道了60种中草药对舒伯特气单胞菌的体外抑菌作用。袁国尚等[14]研究了10种复方中草药对鲟源海豚链球菌的体外抑菌效果。张永花[15]报道了中草药在水产健康养殖中的作用和促进措施。姚丽等[16]研究了30种中草药对鲟鱼源海豚链球菌的体外抑菌作用。【研究切入点】未见利用常见抑菌中草药单剂与复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌抑菌效果的研究报道，结合食品安全和公共卫生需要，从传统中草药中筛选出有效的抗嗜水气单胞菌五倍子、山茱萸、诃子、大黄、乌梅和五味子6种常见抑菌中草药进行试验。【拟解决的关键问题】探明6种单味中草药与复配组方对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果，以期为抗嗜水气单胞菌感染中药组方制剂的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中草药五倍子、山茱萸、诃子、大黄、乌梅和五味子，均购自重庆鑫斛药房连锁有限公司。

1.1.2 病原菌鲫鱼源嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，由水产科学重庆市重点实验室分离与鉴定。

1.1.3 培养基琼脂固体培养基和肉汤液体培养基，由水产科学重庆市重点实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 中草药提取液的制备将五倍子、山茱萸和诃子等6种中草药去除碎石块、砂砾等可见杂质后放入烘箱中60℃烘干，分别称取已烘干的各味中草药50 g，按料液比1∶10的比例用蒸馏水充分浸泡2 h，混合后，采用传统煎煮法，强火加热至煮沸后以文火慢煎 1 h，再用纱布和滤纸进行过滤，收集滤液，置于冰箱中 4℃保存；收集滤渣，按料液比为 1∶5的比例加入蒸馏水 250 mL浸泡 2 h，再按照上述方法煎煮约 1 h，收集滤液，合并 2次滤液蒸发至50 mL，使药液含原药浓度为1 g/mL，制成所需的6种单味煎剂[17]。

1.2.2 试验设计将6种单味中草药煎剂以排列组合方法，按相同比例进行2剂复配、3剂复配、4剂复配、5剂复配和6剂复配，得到57种混合样液和 6种单味样液，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 指标测定

1)中草药提取液体外抑菌圈直径。牛津杯双层琼脂平板法测定供试药液的抑菌效果。无菌条件下将已灭菌的15 mL NB营养琼脂培养基倒入平板内(直径90 mm，下层)，待其凝固后再倒入约5 mL温度50℃左右并混有0.1 mL供试菌菌液(1.0×108cfu/mL)NB营养琼脂培养基(上层)，在凝固后的上层培养基表面放置牛津杯(内径6 mm、外径8 mm、高10 mm)，并轻压使之与培养基无空隙接触，杯中加入200 μL供试药液，28℃恒温培养16～18 h观察结果，采用游标卡尺从3个不同的方向测量抑菌圈直径后取平均值，3次重复；以无菌水为空白对照。

判定标准：20 mm≤抑菌圈直径，为极度敏感；15 mm≤抑菌圈直径<20 mm，为高度敏感；10 mm≤抑菌圈直径<15 mm，为中度敏感；抑菌圈直径<10 mm，为低度敏感[18]。

2)中草药提取液最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。采用试管2倍稀释法测定提取液的MIC，即取13支灭菌小试管，无菌条件下分别加入NB营养肉汤培养基1 mL，1～10号管为试验管。1号管分别加入上述中草药药液1 mL，混匀后吸取1 mL加入到2号管，依次倍比稀释至第10号管并吸取1 mL弃去，则试验组第1管至第10管的药物浓度依次为1 000.00 mg/mL、500.00 mg/mL、250.00 mg/mL、125.00 mg/mL、62.50 mg/mL、31.25 mg/mL、15.60 mg/mL、7.80 mg/mL、3.90 mg/mL、1.95 mg/mL。然后向每管分别加入0.1 mL浓度为1×108cfu/L的菌液；11号管加入0.1 mL药液作为阴性对照管；12号管加入0.1 mL菌液作为阳性对照管；13号管加入0.1 mL NB营养肉汤培养基作为空白对照。在28℃下培养24 h观察结果：试管中液体完全清澈，表明无细菌生长，液体浑浊表明有细菌生长，对药液颜色深肉眼无法判断的试管，取样进一步做平板涂布培养。肉眼观察以无细菌生长试管中的最低药物浓度为MIC。吸取MIC值及其以上浓度的培养物0.1 mL，涂布于NB营养琼脂平板，28℃培养24 h观察结果，以无菌生长或菌落数<5个的药液浓度为该药物的MBC。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPASS 13.0处理数据，结果以平均值±标准差(x±sd)表示。

2 结果与分析

2.1 单味中草药的抑菌效果

从表1可知，6种单味中草药提取液对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑制能力存在差异，菌圈直径为12.69～19.88 mm，依次为五倍子>五味子>大黄>乌梅>诃子>山茱萸。

表1 单味中草药对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果Table 1 The antibacterial effect of single Chinese herbal medicine against A. hydrophila from C. auratus

最小抑菌浓度为15.60～250.00 mg/mL，依次为诃子>山茱萸>五味子>大黄=乌梅>五倍子。最小杀菌浓度为31.25～500.00 mg/mL，依次为诃子>山茱萸>乌梅=五味子>五倍子=大黄。其中，五倍子、大黄和五味子的抑菌能力较强，为高度敏感，其余均为中度敏感。

2.2 2味中草药复配的抑菌效果

从表2可知，2味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑制能力存在差异，抑菌圈直径为10.64～19.98 mm，五倍子+乌梅最大，为19.98 mm；五倍子+五味子其次，为19.94 mm；大黄+五味子最小，为10.64 mm。MIC为15.60～250.00 mg/mL，五倍子+大黄、山茱萸+乌梅、大黄+乌梅和大黄+五味子最大，均为250.00 mg/mL；山茱萸+五味子其次，为125.00 mg/mL；五倍子+乌梅和五倍子+五味子最小，均为15.60 mg/mL。MBC为31.25～500.00 mg/mL，山茱萸+乌梅、大黄+乌梅和大黄+五味子最大，均为500.00 mg/mL；五倍子+大黄和山茱萸+五味子其次，均为250.00 mg/mL；五倍子+乌梅、五倍子+五味子和山茱萸+诃子最小，均为31.25 mg/mL。其中，五倍子+山茱萸、五倍子+大黄、山茱萸+乌梅、山茱萸+五味子、诃子+五味子、大黄+乌梅和大黄+五味子为中度敏感，其余均为高度敏感。

表2 2味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of compounds of two Chinese herbal medicines against A. hydrophila from C. auratus

2.3 3味中草药复配的抑菌效果

从表3看出，3味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑制能力存在差异，抑菌圈直径为9.94～20.26 mm，山茱萸+诃子+大黄最大，为20.26 mm；山茱萸+大黄+乌梅其次，为19.62 mm；五倍子+大黄+五味子最小，为9.94 mm。最小抑菌浓度为7.80～500.00 mg/mL，五倍子+大黄+五味子最大，为500.00 mg/mL；五倍子+乌梅+五味子和大黄+乌梅+五味子其次，为250.00 mg/mL；山茱萸+诃子+大黄最小，为7.80 mg/mL。最小杀菌浓度为15.60～1 000.00 mg/mL，五倍子+大黄+五味子最大，均为1 000.00 mg/mL；五倍子+乌梅+五味子其次，均为500.00 mg/mL；山茱萸+诃子+大黄最小，为15.60 mg/mL。其中，五倍子+大黄+五味子为低度敏感，五倍子+山茱萸+五味子、五倍子+诃子+大黄、五倍子+诃子+五味子、五倍子+乌梅+五味子、诃子+大黄+五味子和大黄+乌梅+五味子为中度敏感，其余均为高度敏感。

表3 3味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial effect of compounds of three Chinese herbal medicines against A. hydrophila from C. auratus

2.4 4味中草药复配的抑菌效果

从表4看出，4味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑制能力存在差异，抑菌圈直径为9.88～21.28 mm，五倍子+诃子+乌梅+五味子最大，为21.28 mm；诃子+大黄+乌梅+五味子其次，为17.84 mm；五倍子+诃子+山茱萸+五味子最小，为9.88 mm。MIC为7.80～500.00 mg/mL，五倍子+大黄+诃子+乌梅和五倍子+诃子+山茱萸+五味子最大，为500.00 mg/mL；五倍子+山茱萸+大黄+五味子和五倍子+大黄+诃子+五味子其次，为250.00 mg/mL；五倍子+诃子+乌梅+五味子最小，为7.80 mg/mL。MBC为15.60～1 000.00 mg/mL，五倍子+诃子+山茱萸+五味子最大，为1 000.00 mg/mL；五倍子+大黄+诃子+乌梅和五倍子+山茱萸+大黄+五味子其次，均为500.00 mg/mL；五倍子+诃子+乌梅+五味子最小，为15.60 mg/mL。其中，五倍子+诃子+乌梅+五味子为极度敏感，五倍子+诃子+山茱萸+五味子为低度敏感，五倍子+山茱萸+诃子+乌梅、五倍子+大黄+诃子+乌梅、五倍子+山茱萸+大黄+五味子、五倍子+大黄+诃子+五味子、山茱萸+诃子+大黄+五味子和山茱萸+诃子+乌梅+五味子为中度敏感，其余均为高度敏感。

表4 4味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果Table 4 The antibacterial effect of four Chinese herbal medicine against A. hydrophila from C. auratus

2.5 5味及6味中草药复配的抑菌效果

从表5看出，5味及6味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑制能力存在差异，抑菌圈直径为14.11～19.07 mm，6味的五倍子+山茱萸+诃子+大黄+乌梅+五味子最大，为19.07 mm；5味的五倍子+诃子+大黄+乌梅+五味子其次，为17.72 mm；5味的五倍子+山茱萸+大黄+乌梅+五味子最小，为14.11 mm。MIC为31.25～125.50 mg/mL，5味的五倍子+山茱萸+大黄+乌梅+五味子最大，为125.50 mg/mL；6味的五倍子+山茱萸+诃子+大黄+乌梅+五味子最小，为31.25 mg/mL；其余5味中草药复配均为62.50 mg/mL。MBC为31.25～125.00 mg/mL，5味的五倍子+山茱萸+诃子+大黄+乌梅、五倍子+山茱萸+诃子+乌梅+五倍子和五倍子+山茱萸+大黄+乌梅+五味子最大，均为125.00 mg/mL；6味的五倍子+山茱萸+诃子+大黄+乌梅+五味子最小，均为31.25 mg/mL；其余5味中草药复配均为62.50 mg/mL。其中，除5味的五倍子+山茱萸+大黄+乌梅+五味子为中度敏感外，其余5味及6味中草药复配均高度敏感。

表5 5味及6味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌效果Table 5 The antibacterial effect of five and six Chinese herbal medicines against A. hydrophila from C. auratus

3 讨论

中草药成分复杂，其中的有效成分对药效提高具有重要作用，其有效成分的提取方法较多，其中水煎法因操作简单而被广泛使用。相同药物对同一种病原菌的抑菌作用存在差异，肖辉等[5]报道，大黄水提物对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为12.90 mm。周群兰等[19]研究表明，大黄提取物对水产养殖中的常见具有良好的抑菌效果,对细菌性疾病具有较强的预防作用。曹红峰等[20]研究表明，不同中草药的抑菌活性明显，五倍子对嗜水气单胞菌的抑菌作用极强,抑菌圈直径达25.63 mm。李笑春等[21]报道，部分中草药的抑菌机理目前尚不完全清楚,个别中草药体内外抗菌效果并不一致，其临床应用效果还须通过动物体内实验加以比较、验证。研究结果表明，6种单味中草药提取液对鲫鱼源嗜水气单胞菌抑菌圈直径为12.69～19.88 mm，依次为五倍子>五味子>大黄>乌梅>诃子>山茱萸，五倍子的抑菌效果最好，为高度敏感，抑菌圈直径为19.88 mm，最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为15.60 mg/mL和31.25 mg/mL。不同中草药配合使用时，部分复配组合抑菌效果增强。其中，2味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为10.64～19.98 mm，五倍子+乌梅和五倍子+五味子的抑菌效果最好，为高度敏感，抑菌圈直径分别为19.98 mm和19.94 mm，MIC和MBC分别为15.60 mg/mL和31.25 mg/mL。3味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为9.94～20.26 mm，山茱萸+诃子+大黄的抑菌效果最好，为极度敏感，抑菌圈直径为20.26 mm，MIC和MBC分别为7.80 mg/mL和15.60 mg/mL。4味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为9.88～21.28 mm，五倍子+诃子+乌梅+五味子的抑菌效果最好，为极度敏感，抑菌圈直径为21.28 mm，MIC和MBC分别为7.80 mg/mL和15.60 mg/mL。5味及6味中草药复配对鲫鱼源嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为14.11～19.07 mm，6味的五倍子+山茱萸+诃子+大黄+乌梅+五味子的抑菌效果最好，为高度敏感，抑菌圈直径为19.07 mm，MIC和MBC均为31.25 mg/mL。但也有部分复配组合抑菌效果降低，可能是因为不同药物提取液中的有效成分有拮抗作用，混合后致使有效成分抑菌能力减弱；同时可能与五倍子有效成分中主要的没食子酸和鞣质使细菌内的蛋白质变性沉淀，使胞内原生质凝固，影响细菌的各种代谢活性，抑制细菌生长等有关[22-24]。研究结果与肖辉等[5]的结论存在差异，可能是因为手段与条件等不一致所致，同时也与所试菌株毒力的强弱、药物的采集区、采集季节、使用部位(根、茎、叶果实、种子)、植物年龄、贮藏炮制方法有关。但与周群兰等[19-21]的结论一致。

目前，中草药在水产病害防控领域应用范围越来越广，具有“绿色防控”水产病害的作用。但单味中草药的抑菌效果往往不理想，与抗生素的抑菌能力存在较大差距。不同中草药配伍使用是提高药效的重要途径。但中草药复配组合后的抑菌能力既可能存在相互促进又存在拮抗的作用。因此，并不是所有效果好的单味中草药经复配组合后其抑菌效果都能得到提高，在实际生产上应根据具体病原菌特性，研制复配组合药剂，并多次进行平行试验，以确定其抑菌能力。