辣木叶多糖提取分离及其抗氧化研究

常雪飞 欧阳茜茜 王韵 孙国庆 田洋

摘要    以辣木葉为原料，首先对植物多糖提取的影响因素及工艺进行研究，其次通过不同体积分数乙醇分级醇沉多糖探索辣木叶多糖的抗氧化性。采用热水浸提法，在单因素的基础上进行正交试验，考察辣木叶多糖得率的影响因素，通过乙醇梯度沉淀分级的方法得到3种辣木叶多糖，分别命名为MP-1（40%乙醇）、MP-2（60%乙醇）、MP-3（80%乙醇），真空冷冻干燥后得到这3种辣木叶粗多糖，并探讨辣木叶多糖体外抗氧化活性。通过单因素及正交试验得出辣木叶多糖的最佳提取工艺为：料液比1：20g/mL、提取温度85℃、提取时间2.5 h、提取次数2次，在此条件下，辣木叶多糖得率为2.039%。体外抗氧化实验表明，MP-1、MP-2、MP-3均具有良好的DPPH自由基清除活性，在辣木叶多糖浓度为25 μm/mL时，MP-1的DPPH自由基清除能力最低，此时MP-3的DPPH自由基清除能力最高，达到85.34%。该提取工艺条件稳定可行，多糖得率较高，且具有较强的抗氧化能力;该提取方法无需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。

关键词    辣木叶;多糖;提取工艺;分级醇沉;抗氧化

中图分类号    S792.99    文献标识码    A    DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.013

Extraction and Isolation of Polysaccharides from Moringa Leaves and Their Antioxidant Activities

CHANG Xuefei1    OUYANG Qianqian1，2，3    WANG Yun1    SUN Guoqing1    TIAN Yang1

（1. School of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University/Engineering Research Center for the Development and Utilization of Edible and Medicinal Resources，Ministry of Education，Kunming，Yunnan 650201，China;2. Marine Biomedical Research Institute，Guangdong Medical University，Zhanjiang，Guangdong 524023，China;3. Zhanjiang Marine Biomedical Research Institute，Zhanjiang，Guangdong 524023，China）

Abstract    Polysaccharides were extracted from the leaves of Moringa oleifera. The influencing factors and technology of the polysaccharide extraction were optimized，and the antioxidant activities of the polysaccharides extracted from the leaves of M. oleifera by ethanol fractional precipitation were analyzed. The hot water extraction method was used to conduct orthogonal experiments based on the single factor experiments to investigate the factors influencing the yield of polysaccharides extracted from the Moringa leaves. Three polysaccharides were fractionated from the Moringa leaves by graded ethanol precipitation，which were named MP-1 （40% ethanol），MP-2 （60% ethanol），MP-3 （80% ethanol）. These crude polysaccharides extracted from the Moringa leaves were vacuum freeze-dried，and their antioxidant activities in vitro were analyzed. Single factor and orthogonal experiments showed that the optimal extraction for Moringa leaf polysaccharides is done when the mate- rial-to-liquid ratio is 1：20 g·mL，extraction temperature 85 ℃，extraction time 2.5 h and extraction frequencies 2 times. Under these optimal conditions the extraction yield of polysaccharides from M. oleifera leaves is 2.039%. Antioxidant activity test in vitro of the polysaccharides showed that MP-1，MP-2，and MP-3 all have good DPPH free radical scavenging activity. When the concentration of the M. oleifera leaf polysaccharides is 25 μg·mL，MP-1 has the lowest DPPH free radical scavenging ability，while MP-3 has the highest DPPH free radical scavenging ability，which is upto 85.34%. This extraction is feasible under these stable conditions，and has a high yield of polysaccharides，and the polysaccharides extracted under these conditions have high antioxidant activities，which lays the foundation for the in-depth study of M. oleifera leaf polysaccharides. The extraction method does not require special equipment，has low extraction cost，and is safe and suitable for large-scale industrial production of the polysaccharides，and it is hence a desirable extraction method.

Keywords    Moringa leaves;polysaccharides;extraction technology;graded alcohol precipitation;antioxidant

辣木（Moringa oleifera Lam.）又称鼓槌树或洋椿树，属白花菜目辣木科辣木属，原产于印度，是一种种植范围广、营养及利用价值极高的多年生树种，具有耐干旱、耐贫瘠、生长迅速、适应性强等特点。有研究表明，口服辣木叶提取物几乎不会对动物体造成任何毒副作用。辣木研究逐步形成产业化及规模化[1-2]。辣木主要种植地分布于印度、南美及东南亚国家，中国主要分布于海南、台湾、广东及云南等地[3]。辣木的叶、根、籽和花均可食用，其中氨基酸、蛋白质以及维生素等营养物质含量丰富。辣木叶不但营养丰富，可作为优质的饲料，还具有抗氧化、降血糖、降血脂的功效，如辣木叶中富含黄酮、酚昔类物质，具有明显的降糖效果，满足人们对饮食营养健康的需求，国家卫生部于2012年将辣木叶批准为新资源食品，可见辣木叶作为新资源食品的研究开发利用价值[4]。

多糖又称多聚糖，是一种分子结构复杂的天然活性成分，一般由10个以上单糖单元组成，广泛分布于动植物、微生物与藻类细胞中[5]。目前已知的天然多糖化合物大约有300多种，其中至少有100多种被应用于临床试验，以制造相关药物。多糖广泛存在于生物体内，是除蛋白质和核酸外另一类能维持机体正常运行的生物大分子，因其在抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂方面的功效，逐渐成为生物化学和分子生物学领域的研究热点[6]。

辣木叶富含大量的多糖，含量8.61%～33.61%不等，是众多优质植物源多糖之一，制备方法多为水提、酶提及酸碱提等。众多研究表明，辣木叶多糖不仅兼具多糖的功效，还对促进肠胃吸收、增强免疫力、调节血糖等有明显作用[7]。目前对辣木叶的研究较少，多集中于提取工艺及体外生物活性验证方面，极少涉及到辣木叶多糖体内生物活性和结构的解析方面。辣木叶多糖能有效清除机体内自由基，提高血液中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等的活性，从而阻断活性氧和自由基的生成，起到抗氧化作用网;此外，辣木叶多糖用于功能性食品的开发也是另外一個研究热点[9]。

本研究以云南德宏地区的辣木叶为研究对象，以水溶性多糖得率为指标，对辣木叶多糖的提取工艺进行了单因素试验和正交试验研究，探讨其多糖提取最佳工艺条件和体外抗氧化活性，为开发云南的辣木叶资源提供科学参考。

1    材料与方法

1.1    材料

1.1.1    试材    辣木叶粉，德宏天佑科技开发有限公司;葡萄糖标准品，北京索莱宝科技有限公司;浓硫酸，重庆川东化工有限公司;5%苯酚，北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇，天津市风船化学试剂科技有限公司;氯仿，成都市科隆化学品有限公司;正丁醇，重庆川东化工有限公司;DPPH试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2    仪器与设备    RE-3000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;FD-1A-50型真空冷冻干燥机（上海比郎仪器制造有限公司）;紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）;HH-11-2型水浴锅（常州诺基仪器有限公司）;JY2002型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）;VL-7F低速冷冻离心机（长沙市白诺克离心机仪器有限公司）;低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

1.2    方法

1.2.1    葡萄糖标准曲线的制作    准确称取干燥至恒重的葡萄糖10mg，然后取适量的蒸馏水溶解，转移到100 mL的容量瓶中，最后加水稀释到容量瓶的刻度线，即可得到0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，标记为标普A;按表1添加相同试剂，快速涡旋震荡30 s，静置30 min，于490 nm处测定吸光度[10]，制作标准曲线。

1.2.2    辣木叶多糖的制备    称取50 g辣木叶粉末，加入1 L的去离子水，于90℃水浴锅中加热回流2 h，以4 000 r/min转速离心20 min，收集上清液，置于45 ℃下，用旋转蒸发仪减压浓缩，待悬蒸至400 mL时取出;加入1/4体积的Sevag试剂（V：V=4：1）进行脱蛋白，混合摇匀30 min，使其充分混匀，离心5 min（4 000 r/min），将上层溶液吸出，置于新的离心管内;继续加入Sevag溶液，至少重复8次，直至无白色絮状沉淀出现;于45 ℃下减压旋转蒸发除去残留的Sevag试剂，并浓缩至200 mL;加入100g AB-8大孔树脂，室温条件下摇晃脱色2 h，抽滤分离滤液，用去离子水清洗3次，合并滤液，减压浓缩至200 mL;在浓缩液中加入4倍的无水乙醇，在4 ℃冰箱中静置过夜;第二天离心10 min（4 000 r/min）得到沉淀，冷冻干燥得到辣木叶粗多糖，最后计算辣木叶多糖的得率。

1.2.3    影响多糖得率的单因素试验

1.2.3.1    液料比对辣木叶多糖得率的影响    准确称取辣木叶粉末2 g，固定提取温度90 ℃，提取时间2 h，提取次数1次，分别考察液料比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30（g/mL）对辣木叶粗多糖得率的影响。

1.2.3.2    提取温度对辣木叶多糖得率的影响    准确称取辣木叶粉末2 g，固定液料比1：20（g/mL），提取時间2 h，提取次数1次，分别考察提取温度75、80、85、90、95℃对辣水叶粗多糖得率的影响。

1.2.3.3    提取时间对辣木叶多糖得率的影响    准确称取辣木叶粉末2 g，固定液料比1：20（g/mL），提取温度90 ℃，提取次数1次，分别考察提取时间1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h对辣木叶多糖得率的影响。

1.2.3.4    提取次数对辣木叶多糖得率的影响    准确称取辣木叶粉末2 g，固定液料比1：20（g/mL），提取温度90 ℃，提取时间2 h，分别考察提取次数1、2、3、4、5次对辣木叶多糖得率的影响[11]。

1.2.4    辣木叶多糖提取的正交试验    在单因素的试验基础上，以料液比、提取温度、提取时间、提取次数来设计四因素三水平的正交试验[12]，以辣木叶多糖得率为考察指标，正交试验因素水平见表2。利用正交设计助手辅助软件设计正交试验方案，见表3。

1.2.5    辣木叶多糖乙醇分级醇沉    在辣木叶多糖浓缩液中加入一定量的无水乙醇，使其体积分数为40%、60%、80%，冷冻干燥得到相应的辣木叶多糖，最后计算辣木叶多糖得率。

1.2.6    多糖得率计算[13]    量取样液2.0 mL，加5% 苯酚溶液1 mL摇匀，迅速加入浓硫酸溶液5 mL，快速涡旋震荡30 s，静置30 min，于490 nm处测定吸光度。

式中：C为辣木叶多糖浓度（mg/mL）;V为辣木叶多糖溶液的体积（mL）;M为辣木叶干粉质量（mg）。

1.2.7    辣木叶多糖的抗氧化活性测定    主要测定辣木叶多糖对DPPH自由基的清除作用[14]。采用氮自由基（DPPH）清除能力测试试剂盒，其中包括试剂一[DPPH 试剂（1 mL）一瓶]、试剂二[100 μg/mL VC 标准溶液（20 mL）一瓶]。

1.2.7.1    试剂配制    试剂一溶液：将DPPH试剂放入37 ℃水浴锅中平衡20 min左右，等待试剂完全融化后，在试剂瓶中加入100 mL的95%无水乙醇，剧烈震荡，使试剂充分混匀溶解。

试剂二溶液：分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL试剂二于试管中，再依次加入9.5、9.0、8.5、8、7.5 mL纯水，使其充分混匀，配制成5、10、15、20、25μg/mL的VC样品。

辣木叶多糖样品溶液配制：称取一定量的MP-1、MP-2、MP-3辣木叶多糖，配制成5、10、15、20、25 μg/mL的辣木叶多糖样品溶液。

1.2.7.2    操作步骤    参照李欣欣等[15]的测定方法，在96孔板上设置空白孔、对照孔、测定孔和VC测定孔，每个孔设置3个平行[16]。其中，空白孔加入试剂一和纯水各1 mL，对照孔依次加入各个浓度的样品溶液1 mL，测定孔依次加入试剂一和各个浓度的样品溶液各1 mL，VC测定孔依次加入各个浓度的VC样品1mL;轻微震动，使其充分混匀，在室温下避光静置30 min使其充分反应，使用酶标仪于517nm处测定其吸光值。

2    结果与分析

2.1    葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线如图1所示。以浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，得到曲线，回归方程Y=5.025 2X+0.103 7，相关系数R=0.999 2，线性关系良好。

2.2    单因素试验结果

2.2.1    料液比对辣木叶多糖得率的影响    料液比对辣木叶多糖得率的影响如图2所示。由图2可知，辣木叶多糖得率随着液料比的增加先升高后降低[17]。其中液料比为1：20时，辣木叶多糖得率最大，得率为1.135%。料液比较小时得率降低的原因可能是，样品与水分没有混匀，造成样品浸提不完全，不利于多糖的溶解，从而造成得率偏低;料液比较大导致得率变低的原因可能是，多糖可与水以任意比互溶，水量越多提取液中多糖的浓度就越低，相同浓度的乙醇就越难将多糖沉淀出来，造成多糖得率降低[18]。因此，液料比选择1：20为宜。

2.2.2    提取温度对辣木叶多糖得率的影响    提取温度对辣木叶多糖得率的影响如图3所示。由图3可知，在75～90℃，辣木叶多糖得率与温度成正比。90 ℃时辣木叶多糖得率达到最大值，得率为1.830%。当温度为90 ℃以上时，随着温度上升，得率降低。其原因可能是温度过高容易破坏多糖的结构，降低多糖的活性，不利于辣木叶多糖的溶解，从而导致得率降低[19]。因此，选择提取温度90℃左右为宜。

2.2.3    提取时间对辣木叶多糖得率的影响    提取时间对辣木叶多糖得率的影响如图4所示。由图4可知，辣木叶多糖得率随着提取时间的增加呈现先增加后降低的趋势。1～2 h之内随着时间的增力口，多糖得率也随之增加[20]，在2 h时达到最大值，得率为1.135%;2～3 h得率反而下降，这是因为较长的加热时间导致多糖分解、结构发生变化，使多糖得率下降[21]。因此，最优提取时间以2h为宜。

2.2.4    提取次数对辣木叶多糖得率的影响    提取次数对辣木叶多糖得率的影响如图5所示。由图5可知，辣木叶多糖得率随提取次数增加呈現先增加后减小的趋势。与第1次相比，第2次多糖得率明显最高，得率为1.774%。但第2次后多糖得率急剧下降[22]，这可能是由于多次长时间加热使多糖分解，从而导致得率下降;此外，每增加一次提取次数会使人力、物力等生产成本增加[23]，因此，提取次数以2次为宜。

2.2.6    辣木叶多糖的得率    通过乙醇分级醇沉将辣木叶多糖分为3个阶段的多糖，分别是MP-1、MP-2、MP-3。这3个辣木叶多糖得率最高的是MP-2，得率为64.70%，MP-1多糖得率最低。

2.2.7    辣木叶多糖的抗氧化活性    辣木叶多糖的抗氧化活性见图6。从图6可看出，阳性对照组（VC）在质量浓度为25μg/mL时，对DPPH自由基的清除能力达到90%以上。与阳性对照组（VC）相比，辣木叶多糖在设置的质量浓度范围内，对DPPH自由基均有一定的清除能力，且随着多糖浓度的增加，DPPH清除能力逐渐增加[26]。综合MP-1、MP-2、MP-3的自由基清除能力可知，在辣木叶多糖浓度为25 μg/mL时，MP-1的DPPH自由基清除能力最低;MP-3的DPPH自由基清除能力最高，达到85.34%。

3    结论

利用热水浸提法提取多糖具有成本低、安全、不破坏有效成分等优点，该工艺合理、成熟，有较高的开发价值。通过单因素试验以及正交试验，可得到对辣木叶多糖得率影响的因素主次排序依次为：提取次数>料液比>提取时间>提取温度，确定辣木叶多糖的最佳提取工艺条件为：料液比1：20 g/mL，提取温度85℃、提取时间2.5 h、提取次数2次，在此工艺条件下辣木叶多糖得率为2.039%。同时，辣木叶多糖具有体外抗氧化活性，随着浓度的升高抗氧化能力逐渐增强，综合3种辣木叶多糖的DPPH自由基清除能力可知，MP-3体外抗氧化活性最佳，MP-1、MP-2也具有一定的抗氧化活性，为辣木叶的特色产品开发提供了一定的理论依据。

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