三氯异氰尿酸粉低温条件下对H9亚型禽流感病毒和细菌的消毒评估

吴蕾 唐磊 常海霞 刘杰 李巍 乔永 崔雪志 许传田

摘 要：实验旨在研究三氯异氰尿酸粉在低温（4℃）条件下分别对流感病毒和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的杀灭效果。以H9亚型禽流感病毒为供试病毒，测定其EID50。将有效氯含量为100、200、400mg/kg和800mg/kg的三氯异氰尿酸粉与定量的H9毒株混合，4℃条件下分别作用3、5、10、20min后接种SPF鸡胚，弃掉24h死亡鸡胚，37℃孵化器培养7d收取尿囊液，用1%鸡红细胞测定血凝价;将有效氯含量为100、200mg/kg和400mg/kg的三氯异氰尿酸粉分别与定量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液混合，4℃分别作用3、5、10、20min后，通过定量杀菌实验测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果。结果表明，低温条件下作用3、5、10、20min后，有效氯含量在200mg/kg以上，对H9病毒的杀灭率均达到100%;有效氯含量在100mg/kg以上，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率达到100%。

关键词：三氯异氰尿酸粉;H9亚型禽流感;低温;大肠杆菌和金黄色葡萄球菌;杀灭率

中图分类号：S859.79+9.1 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2022）03-0056-04

随着养禽业集约化的不断发展，养殖规模越来越大，禽群一旦发生疫病损失巨大，切断传播途径和消灭传染源是疫病控制的有效手段，因此消毒预防是控制禽传染病的重要措施之一[1-4]。

三氯异氰尿酸粉属于有机含氯消毒剂，溶于水后可以生成具有杀菌作用的次氯酸[5]，对水中大部分细菌繁殖体、真菌、病毒芽孢都具有杀灭作用，属于高效消毒剂。本研究通过定量杀菌实验，同时以H9禽流感病毒为供试病毒，检测三氯异氰尿酸粉低温条件下对流感病毒和细菌的杀灭效果。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试试剂 三氯异氰尿酸粉由四川恒通动物制药有限公司生产，批号：20210217。

1.1.2 供试菌株和毒株 大肠杆菌（ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC6538）购买自中国工业菌种保藏管理中心;AIV-H9毒株于2019年1月分离自滨州肉种鸡。

1.1.3 培养基 平板计数琼脂购买自北京陆桥技术股份有限公司，批号：1908208。

1.1.4 SPF鸡胚 66枚9日龄SPF鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡场提供。

1.2 实验方法

1.2.1 Reed-Muench法 將H9毒株分别做10-5、10-6、10-7、10-8、10-9倍稀释，接种SPF鸡胚，每个稀释度接种3枚，弃掉24 h内死亡鸡胚，培养7 d后收集尿囊液，测定血凝价。根据Reed-Muench法计算EID50。

1.2.2 三氯异氰尿酸粉的抗病毒实验 将三氯异氰尿酸粉用灭菌的（121 ℃灭菌20 min）蒸馏水按比例配制成100、200、400 mg/kg和800 mg/kg有效氯溶液，吸取 0.1 mL H9病毒液加入到0.9 mL配制好的氯制剂溶液内摇匀，在4 ℃条件下分别作用3、5、10 min和20 min;立即吸取反应后的混合液0.1 mL加入到0.9 mL 1%硫代硫酸钠溶液（已鉴定合格）中混匀，中和10 min终止反应，接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔0.2mL/枚中和后的混合液，每个稀释度接3枚。弃去24 h内死亡的鸡胚，37 ℃孵化器培养7 d，收取尿囊液，检测血凝价。

同时以1%硫代硫酸钠溶液代替消毒剂溶液同步进行上述各步骤，作为对照组，检测血凝价。

1.2.3 菌悬液的制备 分别吸取大肠杆菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）甘油保藏的菌种100μL接种于100 mL肉汤液体培养基，37 ℃摇床培养 24 h。采用10倍稀释和平板计数法，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液进行计数，用含1%蛋白胨的0.03 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS溶液）将菌液稀释成含约 106～107 cfu/mL的菌悬液。

1.2.4 三氯异氰尿酸粉的杀菌效果实验 将三氯异氰尿酸粉用灭菌蒸馏水按比例配制成100、200、400 mg/kg有效氯溶液，吸取0.5 mL大肠杆菌/金黄色葡萄球菌悬液加入到4.5 mL配制好的消毒液中混匀，4 ℃条件下分别作用3、5、10 min和20 min;立即吸取上述菌液与消毒剂的混合液0.5 L，加入到4.5 mL 1%硫代硫酸钠溶液中混匀，中和10 min终止反应，再吸取1 mL，使用平板计数，琼脂采用倾注法，凝固后倒置于37 ℃培养箱，培养48 h后作菌落计数（整个操作过程在超净工作台中进行）。

同时以洗脱液（含中和剂、1%蛋白胨和0.1%吐温80的PBS溶液）代替消毒剂溶液同步进行上述各操作，作为对照组，计算杀菌率。

2 结果

2.1 H9毒株的EID50结果

按Reed-Muench法计算H9毒株的EID50为10-8/0.2 mL。详细见表1。

2.2 三氯异氰尿酸粉对H9病毒的杀灭效果

检测结果如表2。在4 ℃实验室条件下，三氯异氰尿酸粉杀灭H9病毒能力较强，有效氯含量在200～800 mg/kg范围内，分别作用3、5、10、20min，其杀毒率均可达到100%。

2.3 三氯异氰尿酸粉的杀菌效果

大肠杆菌菌含量是3.05×106 cfu/mL;金黄色葡萄球菌菌含量是6.45×106 cfu/mL。

检测结果如表3。结果表明，在4 ℃条件下，三氯异氰尿酸粉的杀菌能力极强，在100～400 mg/kg的浓度范围内，分别作用3、5、10、20 min，其杀菌率全部达到100%。

3 讨论

2020年新型冠状病毒（COVID-19）在国内外爆发时，含氯消毒剂作为一种价格低廉、毒性较低的高效消毒剂被广泛应用[6]。三氯异氰尿酸粉属于氯制剂，溶于水后生成次氯酸，次氯酸卤化或者氧化细胞蛋白质和脂质而破坏病原体[7]，可以用于车辆、环境及饮用水的消毒。

部分消毒剂易受到低温环境的影响，导致消毒效果不理想，三氯异氰尿酸粉在实验室4 ℃条件下，有效氯量达到100 mg/kg作用 ，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率均可达到100%;当有效氯含量达到200 mg/kg作用3 min，对H9病毒的杀灭率达100%。由此推出，在4 ℃实验室条件下，有效氯含量在200 mg/kg以上时三氯异氰尿酸粉能取得较好的消毒效果。

该实验结果是在实验室条件下得出的数据，禽殖场在使用三氯异氰尿酸粉消毒时会受到消毒对象、有机物、生物膜、污染物、pH等因素的影响，因此畜禽养殖场使用此类消毒剂时需根据消毒对象适当调整消毒浓度，以期达到较好的消毒效果。

参考文献：

[1] 陈吕华，沈明亮，云麟.重视畜禽圈舍及环境消毒是畜牧业健康发展的关键[J].中国兽医杂志，2010，46（1）：86-87.

[2] 袁正东.大型养禽场生物安全体系的建立与保障[J].中国家禽，2012，18 （4）：1-4.

[3] 孙秀如，卢永胜，张梅芳，等.如何建立种鸡场的生物安全体系[J].中国家禽，2008，11（2）：43-44.

[4] 杨丁.规模化养禽场生物安全措施[J].中国家禽，2005，27 （19）：30-31.

[5] 徐兆瑜.新一代高效杀菌消毒剂——氯代异氰尿酸[J].化工之友，2001，6：18.

[6] 赵凯丽.酸性氧化电位水的杀菌机理及其氧化还原性研究[D].西安：第四军医大学，2017：11-15.

[7] Crew J， Varilla R， Rocas TA， et al. NeutroPhase（®） in chronic non-healing wounds[J]. Int J Burns Trauma， 2012， 2（3）： 126-134.