鸡毒支原体MG荧光定量PCR技术评估实验室MG核酸污染方法

张承新 张鹏 彭晓艳 王海兰 曲秀娟 姜皓 卢艳慧 李新 郭龙宗 李玉燕

摘 要：为了评估鸡毒支原体（MG）非免疫鸡群的MG感染，常采用MG荧光定量PCR技术进行监测;而在鸡群的MG净化监控前，需要对实验室进行MG核酸污染评估，无污染后才能进行后续的净化检测工作。本实验采用MG荧光定量PCR技术评估实验室各区域的MG核酸污染情况，如果存在核酸污染，需要采取一系列的消毒措施，直至实验室MG核酸污染监控为阴性。

关键词：鸡毒支原体;荧光定量PCR;核酸污染

中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2022）03-0060-03

荧光定量PCR（real-time PCR），是一种使用荧光定量PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。与常规PCR技术比较，荧光定量PCR可以对起始模板准确定量，能够对扩增反应实时检测;而常规PCR不能。根据荧光收集的机制，荧光定量PCR分为探针法和染料法;本研究采用探针法MG荧光定量试验评估实验室MG核酸污染。

1 材料与方法

1.1 试验仪器及试剂

ABI Q5荧光定量PCR仪（QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Instrument）;RealPCR 败血性支原体/DNA检测混合液，购自IDEXX公司，批号：44B1045，有效期至2022年8月8日。

1.2 采样方法

在1.5 mL离心管中加入适量PCR级水，将植绒拭子浸入离心管中，在离心管壁上挤压，去除多余的水，之后用拭子对实验室各功能间环境样品进行采样;在取样区旋转擦拭2～3次，再将拭子放回离心管中，旋涡震荡混匀，洗脱拭子上的核酸;挤压后拭子弃掉，离心管中液体作为荧光定量PCR待检样品。

1.3 采样区域

根据实验室的布局和实验区域划分，用不同的拭子对每个待检测污染监控区域进行取样，并进行编号。实验室采样区域见表1。

1.4 实验方法

参照试剂盒说明书进行操作，总反应体系为25 μL：目标检测预混液10 μL，DNA扩增预混液10 μL，样品DNA 5 μL。

扩增程序：50 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s ;共45个循环。

2 荧光定量PCR检测结果

实验有效标准：阳性对照FAM Ct值<38，HEX（VIC）<38;PCR阴性对照FAM Ct值无信号，HEX（VIC）≥36。

根据实验室环境采样区域荧光定量PCR检测结果显示：在MG疫苗株或者野毒样品检测后，样品制备室和基因扩增室存在不同程度的MG阳性核酸污染，而试剂制备室为洁净区，未检测到MG阳性核酸污染。实验室环境采样区域荧光定量PCR检测结果见表2。

3 防控措施

3.1 核酸污染去除措施

针对MG阳性核酸污染区域，使用84消毒液或其他含氯消毒液进行消毒处理，使用工作浓度有效氯含量高于2 000 mg/L，可以用试纸条进行浓度含量测定。

污染工作台处理方法：用84消毒液作用5～10 min，再用75%酒精擦拭2～3遍;污染移液器及提取仪等仪器处理方法：用75%酒精擦拭2～3遍;污染功能间与超净台：同时用紫外灯照射30 min。之后再按照操作1的试验方法继续进行环境采样评估，若仍存在核酸污染，按照3.1措施继续进行消毒处理，直至核酸污染彻底清除。

3.2 核酸污染预防措施

3.2.1 制定科学完善的操作规程 为了预防核酸污染问题，首先根据实验室功能，进行分区管理，针对每个实验功能区制定详细的操作流程及技术规范。根据日常核酸污染监控结果，对容易忽略的方面，进行及时补充修订，确保操作规程简单、有效且具有较强操作性。

3.2.2 实验室人流、物流严格控制 人员进入各功能区缓冲间后须更换衣服、拖鞋，每个实验功能区的衣服颜色或款式要求不同，专人专鞋，防止交叉污染。进出各功能区需进行手部消毒，实验前配套手套、口罩。工作服每周用84消毒液进行浸泡清洗。各实验功能区的耗材禁止串用，各区域的垃圾桶、卫生清洁工具、记号笔、移液器等采用颜色管理，不得混用。各功能区须配备相应的去污染消毒试剂，84消毒液、75%酒精喷壶等。工作人员在清洁时按照工作区流程进行，不得逆行。

3.2.3 規范实验室废弃物处理 试验用移液器枪头、试验结束后的提取及PCR耗材先用84消毒液浸泡，再进行密封后丢弃。口罩、手套等浸泡84消毒液后丢弃，丢弃物及时进行清理。