食管癌高危人群预警和早期发现液体活检技术指标研究进展

王立东，吉佳佳，宋 昕，徐瑞华，魏梦霞，赵学科，高社干，周福有，李学民

1)郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室 郑州 450052 2)河南科技大学第一附属医院肿瘤内科 河南洛阳 471003 3)安阳市肿瘤医院胸外科 河南安阳 455000 4)磁县人民医院病理科 河北邯郸 056599

高危人群预警筛查和早期发现是降低食管癌发病率和死亡率的关键[1]。筛查和甄别无症状人群中食管癌高危人群和早期癌患者是食管癌早期发现的主要内容。目前食管癌早期发现最佳方法是内镜筛查，包括食管内镜+碘染色(色素镜)+靶向活检(碘不染色区活检)[2]。内镜筛查需要精密仪器设备、经验丰富的内镜和病理医师等，存在成本高、受检人群依从性差、消毒程序费时等问题，极大限制了其在大规模无症状人群中的应用。

肿瘤细胞及其DNA、RNA和外泌体等成分以及代谢产物，特别是肿瘤关键基因和蛋白以及针对这些蛋白产生的自身抗体等均可被不同程度地释放进入外周血液或人体其他体液中，如唾液、泪液、尿液等。实时监测这些肿瘤相关成分在各种体液中的变化特征就是液体活检的主要内容。很显然，液体活检是一种无创、特异、方便的技术。通过液体活检筛查确定高危人群，再进行色素镜和食管黏膜组织活检，可能是目前提高食管癌高危人群筛查效率的最佳方案[3-13]。液体活检筛查面临的最大挑战是确定最佳液体活检指标。阐明食管癌变早期的分子机制，尤其是食管上皮由正常经各级癌前病变发展到早期食管癌的多阶段演进过程中的分子变化特征和规律，据此确定食管癌变的分子分型标准，最终筛选、优化组合液体活检指标是液体活检技术研究的关键科学问题。

本文就食管癌高危人群预警和早期发现液体活检技术指标研究的进展及所存在的问题做一简要阐述。

1 主要的食管癌高危人群预警筛查和早期发现液体活检技术指标

1.1 高易感单核苷酸变异标志物近年研究[14]发现对食管癌高易感遗传位点进行风险评估，对甄别无症状高危人群、实现食管癌高危人群预警筛查和早期发现具有重要价值。与中国人食管癌遗传易感性有关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点见表1。

1.2 肿瘤相关基因和蛋白一些基因、蛋白或分子的改变与食管癌发生风险、治疗方式、预后等有关，部分具有靶向治疗应用前景。这些畸变分子可能进入组织液，进而进入外周血或其他体液中。目前，通过液体活检技术检测这些分子改变的应用研究尚在起步阶段，特别是当这些分子在体液中含量较少时，液体活检技术检测困难，导致其应用受限。与食管癌相关的关键基因和关键变异见表2。

表1 食管癌遗传易感SNP位点和相关基因

表2 与食管癌相关的19个基因突变率及突变类型

表3列出了从正常、各级癌前病变到早期癌组织中的关键蛋白[13，22-23,25-26]。可以看出，随病变程度的加重，P53、Survivin、Bcl-2、C-myc、EGFR、APC和PLCE1等蛋白的表达逐渐升高，而RARβ、IMP1、P21WAF1、E-cadherin、MGMT和P16等蛋白表达逐渐降低。P53、MUC-1、PCNA、Survivin和ANO1等蛋白的高表达与食管癌预后较差相关，RARβ、E-cadherin、P21WAF1、P16和MGMT等蛋白的高表达预示着食管癌预后较好。

表3 正常食管上皮、各级癌前病变和癌组织中90种肿瘤相关蛋白的表达情况

1.3 食管癌相关抗原、抗体人体免疫系统可以识别自身的变异蛋白并产生特异抗体(自身抗体)，这些自身抗体可以在患者外周血中被检测到，可反映疾病状况。表4和表5列出了目前主要的食管癌相关自身抗体指标在正常和食管癌人群中的阳性率。

表4 主要的食管癌相关抗原指标及阳性率

表5 主要的食管癌相关自身抗体指标及阳性率

1.4 循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)外周血中ctDNA主要来源于肿瘤细胞的游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)片段，长度为150～200 bp[39]，可以在外周血中被检测到。目前可以通过TAm-Seq、Safe-Seqs、CAPP-Seq等靶向高通量测序技术同时检测ctDNA中的多种罕见突变。已有报道，ctDNA中TP53[40]、ERBB2[40]、PIK3CA[40]、KRAS[40]、CDKN2A[41]在正常人群中均未检测到，在食管癌患者中的阳性率分别为50.9%、18.1%、16.3%、14.5%和11.0%；CASZ1、CDH13和ING2的高甲基化在食管癌中尤为明显[42]。

1.5 肿瘤相关代谢产物肿瘤代谢产物可以被释放到各种体液中[43]。食管癌患者与正常人群代谢产物有明显差异，其中差异最大的代谢产物是L-脯氨酸(acid L-proline,LP)、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate,BHBA)和D-甘露糖(d-mannose,DM)，食管癌患者血清LP水平低于正常对照，BHBA和DM水平高于正常对照[44]。

1.6 微小RNA微小RNA(microRNA，miRNA)是在真核生物中发现的一类小的内源性非编码RNA，仅有20～25个核苷酸，有将近一半的miRNA位于人类基因组中与肿瘤相关的区域[45]，其对多种癌基因和肿瘤抑制信号通路具有调节作用，因而受到广泛关注[46]。研究[47-51]显示，miR-21、miR-25、miR-93、miR-42、miR-151和miR-342高表达与食管鳞癌的发生和预后有关；miR-21、miR-192、mir-194、miR-93、miR-200c高表达与食管腺癌的发生有关；miR-203、miR-205、miR-27b、miR-100、miR-125b、let-7c表达下调与食管腺癌和鳞癌的发生有关。

1.7 染色体外DNA(extrachromosomal DNA,ecDNA)ecDNA是游离在细胞质内的、膜包被的DNA片段，主要来源是染色质断裂。ecDNA存在明显的灶性扩增，并与许多肿瘤生物学特征有关，这些灶性扩增的基因片段成为又一种类型的肿瘤相关标志物[52-53]。已有研究[54]发现贲门腺癌组织中ecDNA灶性扩增的频率(78%)与食管鳞癌(80%)非常相似，但与远端胃癌(50%)明显不同；ecDNA中ERBB2基因的灶性扩增和蛋白表达之间存在正相关；ERBB2蛋白高表达患者生存期明显长于阴性表达者。ecDNA为食管癌液体活检提供了新的候选指标和研究思路。

2 液体活检技术类型

食管癌液体活检有可能成为食管癌高危人群预警和早期发现的重要环节(图1)。目前液体活检多是对外周血的检测，很显然，肿瘤相关分子和代谢产物也可能进入其他更容易获得的体液(图2)。唾液是舌下腺、颌下腺的分泌物。唾液腺是最容易又最早受到外界侵袭的部位，与食管的固有腺，尤其是食管中上段的固有腺是同一来源，因此唾液检查能够间接反映食管病变，通过唾液进行液体活检是可行的检查方法[55-56]。尿液是集中的代谢排泄物，在一定程度上反应器官特异代谢，而且在尿液中也能检测到肿瘤相关代谢产物[57-58]，因此尿液中是否有能反映食管癌高危人群预警和早期发现的指标是一个值得研究的课题。人体中另一不能忽视的重要液体就是泪液。泪液被称为人体最纯净的水，但很多因素都会影响到泪液质量，如哭、笑、机械刺激，对于不同个体或同一个体接受不同刺激后泪液成分的差异现在还没有明确结果。这些体液对食管癌高危人群预警和早期发现的重要作用亟待深入系统研究。

图1 食管癌高危人群预警和早期发现流程

图2 食管癌变演进阶段液体活检类型

3 展望

随着越来越多的特异性肿瘤标志物被发现，食管癌液体活检技术将会更广泛地应用于食管癌高危人群预警和早期发现[59-61]。目前，食管癌液体活检筛查技术还存在一些急需改进和完善的问题：一是液体活检的指标急需优化组合。现在各个研究已报道多种液体活检指标，但单个指标筛查的特异度和灵敏度不足以实现食管癌早期发现的目标，要使液体活检技术能够进一步在临床推广应用，尚需更大样本量的队列研发验证，最终获得最佳特异度和敏感度的指标组合，满足简便(仅需一滴血)、低成本和无创的筛查技术要求；二是积极研发其他筛查体液检测技术，尤其是泪液的应用，最终研究成果一定会为食管癌高危人群预警和早期发现液体活检技术领域增加更多的、更有效的、更无创的方法和技术指标。