渔用中草药饲料添加剂的发酵工艺优化

饶毅 徐先栋 肖俊 丁立云 傅义龙 万锦涛 李艳芳

摘要：为提升渔用中草药应用效果，本研究控制中草药发酵过程中的含水量、接菌量、发酵时间和发酵温度，采用单因素试验和4因素3水平的正交试验对发酵工艺进行优化，以蒽酮-硫酸法测定中草药发酵后的多糖含量，最终确定该中草药的最佳发酵工艺为含水量50%，接菌量4%，发酵温度33℃，发酵时间72 h。本研究可为渔用中草药的发酵应用提供参考。

关键词：渔用中草药;乳酸菌;发酵工艺;多糖含量

中图分类号：S948        文献标识码：A

渔用中草药是防治水产动物疾病和改善水产动物体质的经过加工或未加工的药用植物、动物或矿物，其中以植物药占大多数。中草药中含有的活性成分主要包含多糖、生物碱、挥发油、类黄酮、有机酸、单宁等。研究表明，这些活性成分具有增进食欲、加快新陈代谢、促进蛋白质的合成、增加酶活性、提高机体免疫力、增强抗病性、提高肌肉品质等作用。

发酵中草药是将中草药以优选的益生菌作为菌种，通过生物嫁接的方式，在体外模拟肠道环境和中药成分在体内的消化分解过程，对提取的中药有效成分进行生物学转化[1]。中草药经发酵后能提高吸收利用率，增强水生动物的机体免疫力。为了最大程度提升发酵中草药应用效果，对发酵工艺进行优化是提高发酵指标的非常有效的技术手段。本项目利用从草鱼肠道中筛选获得的一株乳酸菌来发酵复方中草药，以多糖含量为指标，通过对发酵过程中的含水量、接种量和发酵时间等进行调控，确定其最佳发酵条件，为渔用中草药的发酵提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

中草药原料：大黄、黄柏、黄芩按5∶3∶2的比例混合，备用。

菌种：乳酸乳球菌CR1（本课题组筛选自草鱼肠道）。

仪器：超净工作台、紫外分光光度计、高压灭菌锅、电子天平、生化培养箱

1.2  试验方法

1.2.1  葡萄糖标准曲线绘制

将葡萄糖样品在105℃烘箱中干燥至恒重，用分析天平称取10 mg于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。用移液枪分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的葡萄糖标准溶液至具塞比色管内，加蒸馏水至1.0 mL。而后各比色管加入硫酸蒽酮溶液（0.2 g蒽酮溶于100 mL浓硫酸中）6 mL，混匀，置于沸水中加热15 min，取出放冷水中15 min后于625 nm测其吸光度值。

1.2.2  中草药含糖量的测定

称取烘干至恒重的中草药样品0.5 g于250 mL三角烧瓶中，加入45 mL 80%乙醇，静置浸泡30 min，超声提取30 min，用滤纸中过滤弃去滤液，将残渣再次置于250三角烧瓶中重复上述操作1次。烘干滤渣后加入2%盐酸45 mL，沸水浴提取1 h，冷却到室温后过滤，将滤液置于100 mL容量瓶中，重复上述操作1次，合并滤液后用2%盐酸定容，混匀。取1 mL提取液于25 mL容量瓶中，用2%盐酸定容后取1 mL于比色管中，加入4 mL新配置的硫酸蒽酮溶液，混匀后沸水浴加热10 min，冷却至室温，于625 nm处测其吸光度。经测定，中草药样品的含糖量为6.64%。

1.2.3  发酵菌液的制备

将乳酸乳球菌CR1接种于5 mL MRS培养基中，37℃培养24 h，传代2次得到活化菌种。将活化菌种以2%接种于装有100 mL MRS培养基的250 mL三角烧瓶中，37℃培养24 h，备用。

1.2.4  中草药灭菌

将中草药放入烘箱中烘干后在超净工作台中装入已灭菌的250 mL三角烧瓶中，每个试验组皆添加27.5 g中草药粉末，于紫外灯下照射30 min灭菌，备用。

1.2.5  单因素试验确定中草药的发酵条件

1.2.5.1  含水量的确定

将已灭菌的中草药加入无菌水，使含水量分别为40%、50%、60%、70%、80%，每组三个重复，接菌量为4%，发酵温度为37℃，200 r/min摇床振荡发酵72 h。发酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法测定多糖含量，确定最佳发酵含水量。

1.2.5.2  接菌量的确定

将已灭菌的中草药加入无菌水，使含水量达到50%，之后分别接入2%、4%、6%、8%、10%的发酵菌液，每组三个重复，发酵温度37℃，200 r/min摇床振荡发酵72 h。发酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法测定多糖含量，确定最佳接菌量。

1.2.5.3  发酵温度的确定

将已灭菌的中草药加入无菌水，使含水量达到50%，接菌量为4%，发酵温度分别为31℃、33℃、35℃、37℃、39℃，每组三个重复，200 r/min摇床振荡发酵72 h。发酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法测定多糖含量，确定最佳发酵温度。

1.2.5.4  发酵时间的确定

将已灭菌的中草药加入无菌水，使含水量达到50%，接菌量为4%，发酵温度为37℃，200 r/min摇床振荡分别发酵24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，发酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法测定多糖含量，确定最佳发酵时间。

1.2.6  正交试验优化中草药发酵条件

单因素试验确定了中草药发酵的最佳含水量、接菌量、温度和时间，在此基礎上设计4因素3水平的正交试验，发酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法测定多糖含量，以此优化最佳发酵方案。

1.3  数据统计处理

用统计软件IBM SPSS16.0对数据进行统计分析。gzslib202204031646

2  结果与分析

2.1  葡萄糖标准曲线

根据吸光度所测结果绘制葡萄糖标准曲线如图1所示，得到回归方程：y=101.33x-0.0251，R2 =0.9964。

2.2  含水量对发酵中草药的影响

含水量对发酵中草药的影响如图2所示。由图2可知，当含水量为50%时，发酵中草药的多糖含量最高，含水量低于50%时，发酵后多糖含量随着含水量的升高而升高，当含水量高于50%时，发酵后多糖含量随着含水量的升高呈下降趋势。因此，单因素条件下选择50%为最佳含水量。

2.3  接菌量对发酵中草药的影响

接菌量对发酵中草药的影响如图3所示。由图3可知，当接菌量为4%时，发酵中草药的多糖含量最高，接菌量为2%～4%时，发酵后多糖含量随着接菌量的升高而升高，当接菌量高于4%时，发酵后多糖含量又逐渐下降。因此，单因素条件下选择4%为最佳接菌量。

2.4  发酵温度对发酵中草药的影响

发酵温度对发酵中草药的影响如图4所示。由图4可知，随着发酵温度升高，发酵后多糖含量也随之升高，当达到35℃时，发酵中草药的多糖含量最高，温度升高多糖含量又呈下降趋势。因此，单因素条件下选择35℃为最佳发酵温度。

2.5  发酵时间对发酵中草药的影响

发酵时间对发酵中草药的影响如图5所示。由图5可知，当发酵时间在24～72 h时，多糖含量逐渐升高，当发酵时间继续延长时，多糖含量随之下降，但变化不明显。因此单因素条件下选择72 h为最佳发酵时间。

2.6  正交试验优化中草药的发酵条件

根据单因素试验确定各因素的水平值，开展4因素3水平的正交试验，试验因素和水平见表1，正交试验方案和结果见表2，方差分析的结果见表3。

由表2可知，4个因素对发酵中草药的多糖含量影响主次顺序为：A（含水量）>D（发酵时间）>B（接菌量）>C（发酵温度），发酵条件的最优组合为A2B2C1D2，即发酵中草药的最佳工艺为含水量50%，接菌量4%，发酵温度33℃，发酵时间72 h。由表3可知，含水量对多糖含量影响显著（P<0.05），接菌量、发酵温度和发酵时间对多糖含量无显著影响（P>0.05）。

3  讨论

发酵是指通过微生物的生长、培养或化学变化，产生大量和积累代谢产物的过程[2]。为了提高代谢产物中有效成份的含量，对发酵过程中的工艺参數进行优化控制是最重要的方法。传统微生物发酵凭主观经验控制，如制作豆豉、酿酒等，主要就是控制温度、湿度等，不能保证发酵过程的稳定。而现代微生物发酵的全过程利用现代生物技术对发酵的工艺条件（发酵菌种、温度、湿度、pH和时间等）进行监控，提高对有效成分的提取率。李嘉懿等[3]利用益生菌发酵复方中草药，优化其发酵温度、培养基初始pH、接种量、发酵时间等工艺参数，结果表明，在优化条件下，发酵中药液的多糖得率是优化前的1.65倍，未发酵的2.51倍。郭舒等[4]利用枯草芽孢杆菌发酵复方中草药，通过试验确定最佳发酵工艺，结果也发现在最佳工艺条件下，含糖量得到显著提高，并发现发酵温度和发酵时间对发酵结果的影响极显著，含水量的影响显著，接菌量的影响不显著。不同的研究中最佳的发酵工艺也存在着差异。宋玉卓等[5]用枯草芽孢杆菌发酵复方中草药，结果表明接菌量对发酵结果影响显著，含水量和发酵时间对发酵结果无显著影响，这可能是因为发酵的中草药不同对发酵工艺产生了影响。本研究也与上述两个研究存在着差异，结果表明含水量影响显著，接菌量、发酵温度和发酵时间无显著影响，因为本研究在发酵过程中发现随着含水量的提高，中草药在发酵过程中会出现结块现象，对发酵结果影响较大。

参考文献

[1]吴炳新，牛纪江，孙筱林，等. 中药发酵制药技术[J]. 山东中医杂志，2001，20（003）：179-180.

[2]王利，周海娇，初歆，等. 微生物发酵工艺及其控制简述[J]. 化工管理，2017（8）：1.

[3]李嘉懿，张红星，谢远红，等. 益生菌发酵复方中草药产多糖的工艺优化[J]. 北京农学院学报，2018，33（3）：5.

[4]郭舒，刁新平，宋玉卓，等. 复方中草药饲料添加剂发酵工艺的研究[J]. 饲料工业，2015，36（5）：4.