粪菌移植对不同溃疡性结肠炎小鼠的疗效及其中药性味研究

马晓飞，胡家丽，崔曼曼，葛巍，杨苏琴，丁成华，张磊昌*

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性免疫性疾病，隶属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的范畴，是消化系统的常见病及疑难病[1-2]，主要以腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等临床表现为主[3]，反复发作是该疾病特点，多见于直肠和乙状结肠，青壮年为好发人群。UC的发病目前在全世界呈逐年上升的趋势，但UC的病因、发病机制尚不明确。现代医学认为与遗传、环境、心理等因素相关，进而导致肠黏膜屏障受损，神经内分泌功能失调和免疫失衡，从而引起肠黏膜局部溃疡而发病[4]。

UC目前还没有治愈的方法，基本治疗原则以控制症状为主，治疗药物包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素类、免疫抑制剂及生物制剂等[5-6]。常规药物不良反应较强，且病情容易反复，生物制剂价格昂贵，经济成本太高。近年来，粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）成为研究热门话题，其原理为将健康人粪便中的功能菌群，移植入患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，治疗肠道及肠道外某些疾病。该方法由来已久，2013年美国食品药品监督管理局将治疗难辨梭状芽孢杆菌感染写入指南，是对其安全性及有效性的认证，适应证得到进一步扩展[7-8]。多数学者虽已经证实FMT治疗UC疗效的可靠性，但仍有部分学者对FMT治疗UC的疗效提出质疑，说其总体有效率偏低。

针对FMT治疗UC疗效参差不齐的原因，笔者基于中医理论，发现金汁与FMT有异曲同工之效[9]。本研究基于此，以阳性药物5-氨基水杨酸（5-ASA）为实验对照，通过FMT治疗普通型溃疡性结肠炎模型（CUCM）与湿热型溃疡性结肠炎模型（DUCM），验证其疗效，通过治疗前后疾病活动指数、肠组织HE染色、肠组织透射电镜、血常规及菌群多样性分析等探究FMT（新金汁）的中药性味。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SPF级C57BL/6小鼠（4周龄）：湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004，平均体质量（18.0±1.2）g。本研究经江西中医药大学医学伦理审查委员会审批通过。

1.2 实验试剂与仪器 葡聚糖硫酸钠（DSS）（9011-18-1，上海源叶生物科技有限公司）；5-ASA（货号：89-57-6，上海源叶生物科技有限公司）；高脂高糖饲料（配方：糖15%、猪油10%、胆固醇4%、胆盐0.3%、蛋黄粉10%、基础饲料60.7%，南京盛民科研动物养殖场）；便隐血（OB）试剂（B200101，珠海贝索生物）；水合氯醛（119957，上海展云化工有限公司）；异氟烷（S10010533，上海玉研科学仪器有限公司）；干扰素 γ（IFN-γ）PE（505808，Biolegend）；CD4 APCCY7（100460，Biolegend）；白介素（IL）-4 PE（504104，Biolegend）；小鼠IL-2试剂盒（MM-0701M1）；小鼠IL-4试剂盒（MM-0165M1）；苏木素染液（ZLI-9610，北京中杉金桥生物技术有限公司）；伊红染色液（G1100，Solarbio）；超净高级封片胶（YZB，BASO）；Scott蓝化液（G1865，Solarbio）；人工气候箱（PRX-80A，江苏天翎仪器有限公司）；动物呼吸麻醉机（ABM-100，上海玉研科学仪器有限公司）；透射电镜（JEM-1230，JEOL）；多功能酶标仪（S/N502000011，TECAN）；显微镜（CX41 OLYMPUS）；切片机（BQ-318D，伯纳）；动物血液细胞分析仪（XFA6030 普朗医疗）[10]。

1.3 模型建立

1.3.1 CUCM 将小鼠适应性饲养7 d后，置于鼠笼饲养IVC系统（设置参数如下：温度20 ℃、湿度45%，每日持续12 h）中饲养，给予普通饲料喂养并给予小鼠自由饮含2% DSS蒸馏水，连续饲养10 d即可。

1.3.2 DUCM 将小鼠适应性饲养7 d后，置于鼠笼饲养IVC系统（设置参数如下：温度36 ℃、湿度80%，每日持续12 h）中饲养，给予高脂高糖饲料（配方：糖15.0%、猪油10.0%、胆固醇4.0%、胆盐0.3%、蛋黄粉10.0%、基础饲料60.7%），并给予小鼠自由饮含2%DSS蒸馏水，连续饲养10 d即可。

造模后，CUCM与DUCM分别取2只小鼠进行观察，取样进行模型验证，通过小鼠疾病活动指数评分（体质量下降分数、大便性状分数、便血分数）和小鼠的一般情况变化（体质量、便血、腹泻、背毛无光泽、拱背、懒动及肛温升高等）来判断造模是否成功。

1.3.3 粪菌制备 取正常对照小鼠的5 g新鲜晨便标本溶于10 ml无菌PBS中充分混匀，分别用2.0、1.0、0.5、0.25 mm的不锈钢筛过滤，6 000×g离心15 min，取菌体，用无菌PBS清洗3次，重悬于25 ml PBS中4 ℃冰箱保存。

1.4 实验分组 于2019年12月9—28日，根据造模需求进行针对性造模，再分为7组，每组各5只小鼠。

1.4.1 正常对照组（Control组） Control组不做任何干预处理，给予小鼠自由饮用正常水，普通饲料喂养，常温、常态下饲养（温度、湿度设置同CUCM组），不做其他特殊处理。

1.4.2 CUCM组 CUCM造模成功后，常温、常态下采用普通饲料、正常饮水饲养，采用磷酸盐缓冲液（PBS）0.2 ml/次对小鼠进行灌肠，1次/2 d，持续10 d，共计5次。

1.4.3 CUCM+FMT组 CUCM造模成功后，常温、常态下采用普通饲料、正常饮水饲养，给予制备的粪菌液0.2 ml对小鼠进行灌肠，1次/2 d，持续10 d，共计5次。

1.4.4 CUCM+5-ASA组 CUCM造模成功后，常温、常态下采用普通饲料、正常饮水饲养，按0.195 g/kg的剂量，药物浓度为0.019 5 g/ml，即20 g小鼠灌肠0.2 ml，1次/2 d，持续10 d，共计5次。

1.4.5 DUCM组 DUCM造模成功后，常温、常态下采用普通饲料、正常饮水饲养，采用PBS 0.2 ml/次对小鼠进行灌肠，1次/2 d，持续10 d，共计5次。

1.4.6 DUCM+FMT组 DUCM造模成功后，常温、常态下采用普通饲料、正常饮水饲养，给予制备的粪菌液0.2 ml对小鼠进行灌肠，1次/2 d，持续10 d，共计5次。

1.4.7 DUCM+5-ASA组 DUCM造模成功后，常温、常态下采用普通饲料、正常饮水饲养，按0.195 g/kg的剂量，药物浓度为0.019 5 g/ml，即20 g小鼠灌肠0.2 ml，1次/2 d，持续10 d，共计5次。

1.5 动物取样 给药结束后，将各组大鼠用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉，打开动物的腹腔及胸腔；将结肠和盲肠取出，表面血迹冲洗干净，用无菌棉签挤出肠道内容物，采用16S rRNA高通量测序技术测定菌群多样性。内容物取出后切去盲肠，将剩余的结肠和直肠分为3份，分别用于HE染色、透射电镜检测、流式细胞检测。

1.6 HE染色 取出各组组织样品流水冲洗数小时，经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，纯乙醇、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ 15 min、Ⅱ 15 min（至透明为止）。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50～60 min。石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水的切片放入苏木素水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返蓝液返蓝15 s，流水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，封片，镜检。

1.7 透射电镜观察 各组组织样品2.5%戊二醛固定2 h以上，用0.1 mmol/L PBS漂洗，1%锇酸固定液固定2 h，0.1 mmol/L磷酸漂洗梯度乙醇（50%～90%）溶液脱水，再丙酮脱水，包埋固化，切片切成厚度为70 nm薄片。3%醋酸铀-枸橼酸铅双染，透射电镜观察。

1.8 流式细胞检测 辅助性T细胞（Th）1细胞检测：各组取100 μl血液至于12孔板中，加入150 μl 1640完全培养基，加入1 μl PMA/Ionomycin mixture佛波酯/离子霉素混合物，放入培养箱中孵育30 min后加入1 μl BFA/Monensin Mixture，放入培养箱中孵育24 h。结束后，将血液转至EP管中离心，弃150 μl上清，将细胞吹匀加入CD4 APC-CY7各5 μl，避光孵育15 min，1 ml PBS，400×g离心5 min洗2次，弃上清。加入500 μl Fixation and Permeabilization Solution避 光 固 定破膜40 min，400×g离心5 min后，加入1 ml 1×BD Perm/WashTMbuffer，清洗2次，再100 μl 1×BD Perm/WashTMbuffer重悬细胞，加入5 μl IFN-γ PE，避光孵育15 min。1 ml 1×BD Perm/WashTMbuffer，清洗2次，再500 μl 1×BD Perm/WashTMbuffer重悬细胞，上流式仪检测。Th2细胞检测步骤同上，CD4 APC-CY7孵育重悬后，Th2检测加入IL-4 PE孵育。

1.9 血常规检测 取各组血液充分抗凝后，室温条件下，采用动物血液细胞分析仪4 h内完成血常规上机检测，主要检测白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）和血红蛋白（HGB）。

1.10 疗效指数评估 比较各组UC小鼠FMT干预前后疾病活动指数的变化，疾病活动指数从体质量变化（体质量不变：0分，体质量下降1%～5%：1分，体质量下降6%～10%：2分，体质量下降11%～15%：3分，体质量下降＞15%：4分）、大便性状（大便正常：0分，大便松散：2分，腹泻：4分）、便血（无便血：0分，隐血阳性：2分，显性出血：4分）3方面进行综合评价。疾病活动指数=（体质量下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。计算CUCM及DUCM的疗效指数，依据尼莫地平法：疗效指数=（治疗后疾病活动指数-治疗前疾病活动指数）/治疗前疾病活动指数×100%，比较FMT干预CUCM及DUCM的疗效指数差别。

1.11 16 S rRNA高通量测序技术测定菌群多样性 各组小鼠肠道内容物过滤后，分为3个测量组，分别为1、2、3，提取总DNA分光光度计进行定量。通常以微生物核糖体RNA等能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点，根据序列中的保守区域设计相应引物，进行PCR扩增。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收，将PCR扩增回收产物进行荧光定量，之后进行高通量测序。使用QIIME软件，调用UCLUST这一序列比对工具，高通量测序所得的序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，然后比对RDP（Ribosomal Database Project）数据库得到分类鉴定结果。

无菌环境下，采集患病鸡的少量新鲜粪便，放置在载玻片上，滴加1滴生理盐水，混合均匀后盖上盖玻片，在低倍显微镜下观察，可观察到呈现卵圆形的球虫卵囊。采集上述病死鸡典型病变肠道组织，轻轻刮取病变较为明显的肠道黏膜表层物放置在载玻片上，加同等量的甘油和生理盐水混合物，盖上盖玻片后，在低倍显微镜下观察，发现存在圆形的裂殖体和裂殖子[2]。无菌环境下采集患病鸡排出的新鲜粪便10 g，用10倍饱和食盐水稀释，充分混合后，静置30 min，用玻璃棒蘸取表面液膜，抖落在载玻片上，在低倍显微镜下观察，可以发现有卵圆形的球虫卵囊存在。

1.12 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组小鼠均造模成功。

2.1 HE染色分析 各组小鼠肠组织HE染色显示：Control组大鼠结肠黏膜完整，腺体排列整齐，无炎性细胞浸润，层次紧密，结构清晰；CUCM组与DUCM组肠黏膜表面出现不同程度的缺损或脱落坏死，部分形成溃疡，隐窝消失，固有层大量炎性细胞浸润，黏膜肌层增厚水肿，黏膜下层血管扩张，较多红细胞、嗜酸粒细胞浸润；CUCM+FMT组、CUCM+5-ASA组、DUCM+FMT组、DUCM+5-ASA组肠黏膜基本完整，极少数仍见残缺断裂，腺体增生，排列尚整齐，杯状细胞增多，出血点消失，可见少量炎性细胞浸润，并且DUCM+FMT组与CUCM+FMT组相比，前者腺体较后者排列整齐并紧密，残缺断裂也较后者少，见图1。

图1 各组小鼠肠组织HE染色（×200）Figure 1 Morphology of intestinal tissue of mice in each group stained with H&E

2.2 透射电镜分析 各组肠组织透射电镜超微结构显示：Control组微绒毛形态规则，排列整齐，较多杯状细胞，线粒体丰富，嵴结构清楚，粗面内质网未见改变；CUCM组与DUCM组上皮细胞表面微绒毛稀疏，长短不一，形态不规则，细胞连接间隙增宽，杯状细胞减少，胞浆内有空泡，线粒体肿胀，部分嵴消失，个别内质网扩张或呈空泡变化；CUCM+FMT组、CUCM+5-ASA组、DUCM+FMT组、DUCM+5-ASA组微绒毛较为致密，形态正常，杯状细胞数目较多，线粒体轻微肿胀，粗面内质网病变不明显，并且DUCM+FMT组与CUCM+FMT组相比，前者的微绒毛较后者紧密，杯状细胞也较后者多，见图2。

图2 各组小鼠肠组织透射电镜超微结构观察（×13 000）Figure 2 Ultrastructural observation of intestinal tissues of mice in each group by transmission electron microscope

2.3 流式细胞检测 各组小鼠Th1、Th2细胞含量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 各组小鼠肠组织Th1、Th2细胞含量比较（±s，%）Table 1 Comparison of Th1 and Th2 cell contents in intestinal tissues of mice in each group

表1 各组小鼠肠组织Th1、Th2细胞含量比较（±s，%）Table 1 Comparison of Th1 and Th2 cell contents in intestinal tissues of mice in each group

注：Control=正常对照，CUCM=普通型溃疡性结肠炎模型，DUCM=湿热型溃疡性结肠炎模型，FMT=粪菌移植，5-ASA=5-氨基水杨酸，Th=辅助性T细胞；a表示与Control组相比P＜0.05；b表示与CUCM组相比P＜0.05；c表示与CUCM+FMT组相比P＜0.05；d表示与CUCM+5-ASA组相比P＜0.05；e表示与DUCM组相比P＜0.05

组别 例数 Th1 Th2 Control组 5 10.88±2.02 4.95±2.10 CUCM 组 5 17.20±3.60 3.46±1.31 CUCM+FMT 组 5 17.23±3.77 3.33±1.35 CUCM+5-ASA 组 5 13.69±5.09 5.72±1.57 DUCM 组 5 24.53±6.39abcd 1.78±0.68d DUCM+FMT组 5 13.55±2.35e 2.17±0.98d DUCM+5-ASA 组 5 14.65±2.99e 2.33±1.33d F值 5.97 5.61 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 血常规检测 各组小鼠WBC、RBC、PLT、HGB比较，差异均有统计学意义（P＜0.001），见表2。

表2 各组小鼠血常规比较（±s）Table 2 Comparison of routine blood of mice in each group

表2 各组小鼠血常规比较（±s）Table 2 Comparison of routine blood of mice in each group

注：WBC=白细胞计数，RBC=红细胞计数，PLT=血小板计数，HGB=血红蛋白；a表示与Control组相比P＜0.05；b表示与CUCM组相比P＜0.05；c表示与CUCM+FMT组相比P＜0.05；d表示与CUCM+5-ASA组相比P＜0.05；e表示与DUCM组相比P＜0.05

组别 例数 WBC（×109/L） RBC（×1012/L） PLT（×109/L） HGB（g/L）Control组 5 3.54±0.74 5.38±0.20 264.20±37.16 109.92±4.35 CUCM 组 5 9.64±1.32a 3.57±0.18a 333.00±29.34 90.50±5.65a CUCM+FMT 组 5 7.16±0.86ab 5.05±0.30b 322.00±25.40 108.00±7.84b CUCM+5-ASA 组 5 4.35±0.44bc 4.98±0.27b 310.00±30.70 103.80±6.26b DUCM 组 5 7.74±0.88abd 3.65±0.35acd 392.20±45.79abcd 91.38±7.86acd DUCM+FMT 组 5 4.42±0.56bce 5.55±0.15be 302.00±41.36e 110.00±5.61be DUCM+5-ASA 组 5 5.13±0.43bce 5.90±0.46bcde 300.60±34.30e 108.00±5.52be F值 38.47 49.34 6.13 9.30 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 疗效指数分析 CUCM+FMT组疗效指数为（-31.03±4.71）%，CUCM+5-ASA组疗效指数为（-62.53±7.53）%，DUCM+FMT组疗效指数为（-56.58±13.29）%，DUCM+5-ASA组疗效指数为（-50.47±20.86）%，各组疗效指数比较，差异有统计学意义（F=5.41，P=0.009）；其中CUCM+5-ASA组、DUCM+FMT组、DUCM+5-ASA组疗效指数高于CUCM+FMT组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.6 菌群多样性分析 对各组小鼠肠内容物进行菌群多样性分析，其中Rank-abundance曲线表示物种的丰富程度（图3a），曲线越宽，表示物种的组成越丰富，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高；非度量多维尺度分析（图3b）、Beta多样性PCA成分分析（图3c）、PCoA主坐标分析（图3d）表示微生物群落相似度，样品彼此之间靠得越近，表示微生物群落相似度越高。结果显示，CUCM+FMT组、DUCM+FMT组经治疗后有逐步向Control组靠拢的趋势，表明肠道菌群正在改善。对各组样本属水平分类差异统计与相对丰度分析，结果显示，相较于Control组，CUCM组中丰度显著降低的属分别是 Ruminococcus、Unclassfied_Lachnospiraceae，显著升高的属分别是Akkermansia、Clostridium_XIVa、Unclassfied_Porphyromonadaceae； 相较于 Control组，DUCM组中丰度显著降低的属分别是Helicobacter、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、Ruminococcus，DUCM组中丰度显著升高的属分别是Akkermansia、Bacteroides、Parabacteroides、Klebsiella。经过FMT治疗后，CUCM+FMT组、DUCM+FMT组有逐步向Control组靠拢的趋势，表明肠道菌群正在改善，见图4。

图3 各组小鼠肠内容物菌群多样性分析Figure 3 Diversity analysis of intestinal microbiota in mice in each group

图4 小鼠肠内容物菌群属水平差异分析Figure 4 Comparative analysis of intestinal microbiota of mice in each group at the genus level

3 讨论

目前关于FMT治疗UC的机制认为可能与改善肠道菌群结构，酸化肠道抑制致病菌生长，提高肠道抗炎代谢物如短链脂肪酸水平，增加有益菌丰度，改善Th1/Th2细胞平衡，调节促炎因子与抗炎因子的平衡，诱导机体免疫系统对肠道菌群产生免疫耐受等多方面有关[11-12]。

根据本研究HE染色病理学、透射电镜超微结构结果分析，FMT对CUCM与DUCM两种UC模型小鼠均有显著的疗效，且对DUCM效果优于CUCM。流式细胞检测结果表明FMT可以使DUCM模型组中Th1细胞减少，Th2细胞增多。血常规表明FMT可以使UC模型中WBC、PLT下调，RBC、HGB上调，并且DUCM组的各项指标改善均优于CUCM组。疗效指数分析表明DUCM组的疗效指数高于CUCM组。同时菌群多样性结果也显示FMT可以使UC模型中的菌群趋于正常。

T淋巴细胞在机体的免疫应答和免疫调节作用中占据着中心地位，Th细胞为初始CD4+T细胞活化后分化而成的效应细胞，其通过释放细胞因子、辅助B细胞活化产生抗体，以及和细胞间直接接触的方式发挥免疫效应[13]。在受到不同性质抗原和局部微环境中细胞因子调控后，Th细胞主要可分化为Th1、Th2等两个亚型。Th1细胞以分泌IL-2、IFN-γ等为主，参与细胞免疫应答、炎性反应和急性排斥反应过程；Th2细胞以分泌IL-4、IL-5为主，参与体液免疫应答[14-15]。根据研究UC模型中Th1细胞及Th2细胞，经FMT治疗后，DUCM模型组Th1/Th2平衡更趋于Control组。

肠道菌群紊乱与多种疾病的发生有密切联系，如哮喘、肥胖、糖尿病等，尤其是胃肠类疾病[16]。有研究表明，大肠湿热证UC患者与健康人肠道菌群的差异明显：其中，大肠湿热证UC患者的Bacteroidetes和Firmicutes的细菌均低于健康人，但是Proteobacteria和Verrucomicrobia的比例高于健康人且大肠湿热证UC患者的多样性均高于健康人肠道样本[17]。根据本研究的菌群差异结果显示，属水平差异显著的是Ruminococcus与Akkermansia，推测可能与疾病的发生及治疗有关。

综上可知，FMT治疗UC模型小鼠效果明显，并且针对DUCM优于CUCM。反之，苦味具有清泻、燥湿作用，一般清热、泻火、燥湿、通便药物均具有苦味，苦味药物主治热证、火证及湿证。根据中医八纲辨证施治理论“寒者热之，热者寒之”，即热证、火证均可以使用具有寒凉属性的药物治之。根据本研究证实FMT对DUCM疗效优于CUCM，进而根据中医药理论推导，新金汁属于中药中的苦寒之物。本研究为FMT治疗UC提供了理论依据，也为FMT（新金汁）的中药性味苦寒提供了理论依据，但还需深入研究。

作者贡献：张磊昌提出论文思路、实验设计方案，对文章整体负责，监督管理；丁成华进行动物造模及取样处理、实验指标检测；胡家丽、崔曼曼进行数据收集及数据整理；葛巍进行统计学处理；杨苏琴进行结果解读；马晓飞撰写论文初稿、绘制图表；马晓飞、张磊昌进行论文的修订；丁成华、张磊昌负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。