外用红油膏对大鼠体内汞蓄积及肝肾功能的影响*

葛巍 廖武 张梦婕 杨苏琴

（江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

红油膏是由九一丹、东丹按比例配以凡士林调和而成的矿物类中药外用制剂，具有拔毒祛腐、敛疮生肌之功效，临床上多用于肛周脓肿、肛瘘、肛窦炎、乳痈及慢性皮肤溃疡等脓腐或难愈创面，且疗效稳定、确切[1～2]。九一丹作为红油膏疗效的重要来源，其中升丹主要成分为氧化汞（HgO），有研究显示超剂量、长时间用药可能导致体内汞蓄积甚至汞中毒，易造成肝肾功能损伤[3]。由于红油膏在肛肠疾病中的应用范围较广且疗效确切，但对其毒副作用、用药剂量及时间的研究鲜有报道。因此，本实验通过大鼠外用不同剂量红油膏1个月，并观察其血液、尿液、肝脏及肾脏中汞含量和肝肾功能，以期为红油膏临床安全性提供数据参考。现报道如下：

1 材料

1.1 药品与试剂 红油膏粉（煅石膏、升丹、东丹按9:1:1.5比例混合制成），由江西中医药大学附属医院药剂科配制；医用凡士林纱布（国械注准20193141543）；水合氯醛溶液（江西省儿童医院，批号H20120021）；75%乙醇溶液（江西健宝医药科技有限公司，批号20201006）；氯化钠注射液（国药准字H10983065）；汞标准液（1 000μg/ml，中国计量科学研究院）。

1.2 仪器 3110全自动生化分析仪（日本HITACHI公司）；RA-915M赛曼原子吸收汞分析仪（北京Lumex分析仪器公司）；5430R小型台式高速冷冻离心机（Eppendorf艾本德中国有限公司）；ME55型1/10万电子天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）。

1.3 动物 SPF级SD大鼠40只，体质量200 g，雌雄各半，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。置于江西中医药大学动物实验中心分笼饲养，恒温恒湿，采食全价标准饲料，自由饮水，适应性喂养7 d后开始实验。动物实验严格遵守江西中医药大学实验动物中心动物伦理委员会要求，批准号：JZLLSC20210024。

2 方法

2.1 不同剂量红油膏的制备 将煅石膏、升丹、东丹研极细粉，过80目筛，按9:1:1.5比例混合制成红油膏粉[4]。根据九一丹人体临床日均剂量为200 mg（上海中医药大学附属龙华医院提供）[5]，按人与大鼠体表面积换算，人体表面积约1.6 m2（体质量60 kg），则人日均剂量为125 mg/m2；大鼠表面积约0.033 m2（体质量0.2 kg），则大鼠日均剂量为4.125 mg[6]。因此，大鼠红油膏粉日均剂量为4.744 mg（相当于人体临床日均剂量230mg）。称取红油膏粉4.744 mg、94.875 mg、189.750 mg均匀涂抹于3 cm×3 cm医用凡士林纱条上，制成低剂量红油膏纱条（相当于正常剂量）、中剂量红油膏纱条（相当于正常剂量20倍）、高剂量红油膏纱条（相当于正常剂量40倍）。

2.2 实验分组与给药 将40只大鼠随机分成4组（正常组、红油膏低剂量组、红油膏中剂量组、红油膏高剂量组），每组10只。按体质量予以10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，大鼠背部剃毛，面积约5 cm×5 cm，用橡皮筋捆住四肢，呈腹卧位固定在大鼠固定板上，75%乙醇局部消毒手术区，选择距肩胛骨以下2 cm，以背中部脊柱为中点制作3 cm×3 cm的全层皮肤缺损创面，深至深筋膜层，形成机械损伤动物模型，每隔3 d用刀片刮伤，保持新鲜、不愈合状态。给药前予以氯化钠注射液清洗创面，正常组予以医用凡士林纱条贴敷，给药组分别予以红油膏低剂量纱条、红油膏中剂量纱条、红油膏高剂量纱条贴敷。换药结束后予纱布覆盖，胶布固定，每日换药1次，持续30 d。

2.3 体内汞蓄积测定 持续给药30 d，第30天收集各组大鼠24 h尿液。给药结束次日，大鼠麻醉后腹主动脉取全血置于抗凝管，静置1 h，4℃、3 500 r/min离心10 min，取血清置于EP管；同时摘取肝脏和肾脏制备组织匀浆，4℃、3 500 r/min离心15 min，分离上清液置于EP管。用赛曼原子吸收汞分析仪检测大鼠尿液、血液、肝脏及肾脏中的汞含量。

2.4 肝肾功能检测同上述方法制成血清，用全自动生化仪测定大鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）的含量。

2.5 统计学方法数据处理采用SPSS22.0统计学软件，计数资料以%表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 红油膏对大鼠血液、尿液、肝脏及肾脏中汞含量的影响持续30 d给药后，相比正常组，红油膏低、中、高剂量组的血液和尿液中汞含量均明显升高（P＜0.05，P＜0.01），且红油膏中、高剂量组的肝脏、肾脏中汞含量均明显升高（P＜0.01）。相比红油膏低剂量组，红油膏中、高剂量组尿液、肝脏、肾脏中汞含量均明显升高（P＜0.01）。相比红油膏中剂量组，红油膏高剂量组尿液、肾脏中汞含量均明显升高（P＜0.01）。见表1。

表1 红油膏对大鼠血液、尿液、肝脏及肾脏中汞含量的影响（x±s）

3.2 红油膏对大鼠肝肾功能的影响 持续给药30 d后，在肝功能方面，红油膏高剂量组中AST含量较正常组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其余各给药组中ALT、AST的含量与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在肾功能方面，相比于正常组，红油膏中、高剂量组中BUN与CREA含量均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 红油膏对大鼠肝肾功能的影响（x±s）

4 讨论

中医丹药应用起源于春秋战国，至明清达到鼎盛时期，尤其在中医外科领域收获奇效[7]。但其中不乏含有铅、汞、砷等有毒成分，长期应用时应时刻警惕这些有毒成分蓄积及靶器官毒性反应[8]。除了口服途径以外，现代研究发现含汞矿物类中药外用也是造成汞蓄积及慢性肝肾损伤的重要原因，且主要与用药剂量及时间有关[9]。因此，亟待开展红油膏外用安全性及毒性研究的动物实验。

在体内汞蓄积方面，大鼠持续红油膏给药30 d后，汞在血液和尿液中存在不同程度的蓄积，随着用药剂量的逐渐加大，肝肾脏出现明显汞蓄积，其中尿液和肾脏的汞蓄积呈一定剂量依赖性。特别注意的是肝脏、肾脏在正常临床日均用量下汞蓄积量未见明显差异。上述结果提示正常临床日均用量下外用红油膏30 d对肝脏、肾脏汞蓄积影响较小，而过量使用红油膏是导致肝肾汞蓄积的主要因素。汞在体内代谢周期长，易产生体内蓄积及靶器官毒性反应，有研究显示小鼠连续2周灌胃朱砂可发现小鼠的肝脏、肾脏、血液均有明显汞蓄积[10]。体内汞蓄积实验表明长期给药的汞蓄积量为肾脏＞脑＞肝脏＞血液，而单次给药的汞蓄积量为肝脏最多[11]。肾脏作为汞的主要排泄器官，汞蓄积可引发肾脏中半胱氨酸-汞-半胱氨酸耦合物形成、脂质过氧化损伤以及有机阴离子转运体Oat1和Oat受到抑制，进而导致肾小管上皮细胞肿胀坏死、皮质增厚、肾肿大等肾实质损伤[12]。汞还可与体内靶器官中的谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶等产生结合作用，导致含巯基的抗氧化剂损耗及蛋白质损伤，进而引发氧化应激介导的肝损伤[13]。

对大鼠肝肾功能的相关指标检测发现，低剂量红油膏对ALT、AST、BUN、CREA水平影响较小，而高剂量红油膏可致AST含量明显升高，中、高剂量红油膏也可致BUN、CREA含量明显升高。血清ALT、AST是评价肝功能的重要指标，汞蓄积可诱导脂质过氧化，进而引发ALT、AST等肝功能异常升高[14]。血清BUN、CREA是评价肾小球滤过功能的经典指标，两者水平升高能够间接反映肾脏损伤程度[15]。上述实验结果提示超剂量使用红油膏可对肝肾功能造成损伤，而持续30 d的正常临床日均用量未见明显的肝肾毒性。然而，上述实验中红油膏中剂量组中AST含量与肝脏汞蓄积量存在滞后性，这也提示AST在评价汞蓄积所致肝毒性的灵敏度方面可能存在误差。中、高剂量红油膏中BUN、CREA含量上升趋势与肾脏汞蓄积量一致，表明BUN、CREA可能是评价红油膏汞蓄积所致肾毒性的可靠指标。

综上所述，红油膏长期、超量给药可造成大鼠体内血液、尿液、肝脏、肾脏中汞蓄积及肝脏、肾毒性，但日均剂量4.744 mg（相当于人体临床日均剂量230 mg）且持续30 d外用红油膏粉对肝肾脏汞蓄积及肝肾功能影响较小，可为红油膏临床安全性提供数据参考。尽管如此，人体临床日均剂量230 mg红油膏在血液和尿液中汞蓄积仍不可避免，建议通过减少使用时间以保障红油膏临床用药安全。对于儿童、孕妇、老年人等特殊人群仍然缺乏相关安全性评价证据，建议禁用、慎用。