滇西33种菊科植物体外降脂活性研究

郎利娟，崔淑君，朱起杰，3，杨 丽，3，王 影，3，姜 北，3，肖朝江，3*

（1.大理大学药物研究所，云南大理 671000；2.大理大学药学院，云南大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室（培育），云南大理 671000；4.毕节医学高等专科学校，贵州毕节 551700）

脂质代谢紊乱俗称血脂异常或高脂血症，是指血液中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）或甘油三酯（TG）中的一项或多项过高，或伴有高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平过低为特征的一类代谢性疾病。脂质代谢紊乱与糖尿病、阿尔茨海默病、肥胖、癌症和动脉粥样硬化性心血管疾病等多种疾病的病理有关〔1-2〕。据世界卫生组织统计，2016年估计有1 790万人死于心血管疾病，占全球死亡总数的31%；非传染性疾病导致的1 700万70岁以下死亡人群中，37%由心血管疾病造成〔3〕。研究表明，血脂异常能显著增加心血管疾病的患病率和病死率〔1-2〕。因此，降低血脂可以有效地干预动脉粥样硬化的进展，减少心血管疾病的风险。

菊科（Compositae）植物全球约有1 000属，2.5万～3万种，广泛分布于世界各地。我国约有200余属，2 000多种，遍布全国各地，种类繁多，且许多种类富有经济价值，如莴苣、莴笋、茼蒿、菊芋等为日常食用蔬菜，向日葵、小葵子、苍耳的种子可榨取食用或工业用油，橡胶草和银胶菊可提取橡胶〔4〕。此外，许多菊科植物还具有良好的降脂活性。例如，菊科植物Solidago chilensis醇提物及其主成分槲皮素具有降低胆固醇和预防动脉粥样硬化的作用〔5〕；Launaea taraxacifolia的叶具有显著的体外降脂活性〔6〕；北艾Artemisia vulgaris具有降血脂、抗炎、抗氧化作用，可作为预防动脉粥样硬化和心血管疾病的药物〔7〕；蓍Achillea millefolium的甲醇提取物和水提物对四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠具有显著的抗高血糖和降血脂活性〔8〕；白莲蒿Artemisia sacrorum95%乙醇提取物能显著降低人肝癌细胞HepG2的脂质积累〔9〕；含有红花Carthamus tinctorius提取物的丹红注射液能明显增加肝脏脂肪分解，减少脂肪酸合成〔10〕。

为从植物中发现高效、低毒副作用的新型降脂药物，本研究通过高脂细胞模型对采自滇西的33种菊科植物进行体外降脂活性筛选，以期能发现活性较好的药用植物，为寻找植物来源的新型降脂天然产物奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器BSC－1000-Ⅱ-A2生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；5510E CO2培养箱（美国NuAire公司）；DT5－6低速台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；M700E倒置显微镜（日本Nikon公司）；Varioskan LUX多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Coolsafe 95－15冷冻干燥机（丹麦Labo Gene公司）；AL204电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）；HVE－50高压灭菌锅（日本Hirayama公司）；DW－86L628－80℃低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；RE－5205旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 细胞株和试药人肝癌细胞HepG2由中国科学院昆明植物研究所黎胜红研究员惠赠；Gibco RPMI 1640干粉培养基（批号：2126369）、Gibco澳洲特级胎牛血清（FBS，批号：1414426）均购自美国Invitrogen公司；细胞培养级二甲基亚砜（DMSO，批号：RNBF6155）购自美国Sigma公司；4－羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，批号：513C046）、青霉素－链霉素溶液（批号：20190125）、胰蛋白酶－乙二胺四乙酸消化液（批号：20190819）均购自北京索莱宝科技有限公司；油酸（OA，批号：C10375483）、油红O（批号：C10096989）均购自上海麦克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA，批号：EZ6789D116）购自德国Biofroxx公司；棕榈酸钠（PA，批号：C04D10A104981）购自上海源叶生物科技有限公司；辛伐他汀（批号：WZG110808－039N）购自美国Ark Pharm公司；CCK－8试剂盒（批号：20200701）购自杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 植物样品33种菊科植物样品均采自滇西地区，由大理大学药学院生药教研室张德全教授鉴定，植物标本现均存放于大理大学药物研究所。植物信息见表1。

表1 33种菊科植物样品的基本信息

2 方法

2.1 植物提取物的制备33种菊科植物样品干燥后粉碎，75%乙醇回流提取3次，合并后的提取液用旋转蒸发仪在50℃以下除去乙醇，转移至冷冻干燥机上冷冻干燥，得相应冻干粉，备用。

2.2 细胞活力检测参考文献〔11〕方法，采用CCK－8试剂盒进行细胞活力检测。简要步骤如下：HepG2细胞以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板，置于37°C、5%CO2环境下培养24 h。设置空白组、阴性对照组、供试组（模型组和给药组）。空白组无细胞，仅含同体积RPMI 1640培养基；阴性对照组含细胞，不加诱导剂和各提取物；模型组含细胞和诱导剂；给药组含细胞、诱导剂和各提取物。诱导剂为经40%BSA结合的0.6 mmol/L OA和0.3 mmol/L PA；各提取物终浓度为0.5 mg/mL。培养24 h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液。继续培养4 h后，用酶标仪测定各组在450 nm处的吸光度（OD）。细胞活力按以下公式计算：细胞活力（%）=［（供试组OD值-空白组OD值）/（阴性对照组OD值-空白组OD值）］×100%。

2.3 体外降脂活性测试参考文献〔12〕方法，进行体外降脂活性测试。简要步骤如下：HepG2细胞以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板，置于37℃、5%CO2环境下培养，细胞丰度达90%以上时，将旧培养液（含10%FBS的RPMI 1640培养液）更换为含诱导剂的新鲜培养液，阴性对照组换为含有与诱导剂同体积的40%BSA培养液。培养24 h后，给药组每孔加入20μL提取物溶液，终浓度为0.5 mg/mL，空白组与模型组每孔加入20μL相应溶媒（植物提取物溶媒为灭菌超纯水，辛伐他汀溶媒为DMSO）。继续培养24 h，小心移除孔内培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1次，每孔加入60μL 10%的甲醛溶液。固定30 min，移除固定液，PBS清洗1次，每孔加入60μL 0.4 mg/mL油红O工作液染色。60 min后，移除染色液，PBS冲洗3次，置倒置显微镜下观察细胞内脂滴染色情况。最后每孔加入200μL异丙醇（分析纯），充分溶解后，酶标仪测定波长510 nm处各组的OD值。降脂率按以下公式计算：降脂率（%）=［1-（给药组OD值-空白组OD值）/（模型组OD值-空白组OD值）］×100%。

2.4 统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据用（±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

细胞活力检测结果表明，在0.5 mg/mL浓度下，除多花百日菊给药组细胞几乎全部死亡外，其余植物提取物均无明显的细胞毒性。体外降脂活性筛选结果显示，阳性药物辛伐他汀终浓度为50μmol/L时，无细胞毒性，体外降脂率为（11.4±2.9）%。筛选的27属33种菊科植物中有19属24种（占比70%以上）具有不同程度的降脂活性；其中降脂率大于10%的有10属、12种，约占1/3。在筛选出的具有降脂活性的植物中，熊胆草、紫茎泽兰降脂活性最好，体外降脂率分别为（18.4±1.9）%、（18.4±9.7）%，其次是狼杷草和肿柄菊，体外降脂率分别为（17.5±10.2）%、（15.1±13.4）%，此4种菊科植物提取物与辛伐他汀体外降脂率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 33种菊科植物体外降脂活性筛选结果（x±s，n=4）

4 讨论

血脂异常是心血管疾病发生及发展的主要因素之一。对于中高风险的高脂血症患者，可以通过改变不健康的生活方式和药物干预进行降脂。目前，传统的调血脂药物主要有他汀类、贝特类、烟酸类、依折麦布、胆汁酸螯合剂等，随着研究的不断深入，一些新型调血脂靶点和降血脂药物逐渐被发现。在脂质代谢中，除了著名的羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG－CoA）外，前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）、载脂蛋白B（ApoB）、载脂蛋白C-Ⅲ（ApoC－Ⅲ）、微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）、ATP柠檬酸裂合酶（ACL）、血浆胆固醇酯转运蛋白（CETP）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα），以及人血管生成素样蛋白（ANGPTL）等均扮演着重要角色，但是无论是传统调血脂药物还是新型降血脂药物都具有诸多局限性及不良反应〔13－14〕，因此，寻找安全、高效的新型降血脂药物已然成为一项长期且艰巨的研究。

据文献报道，目前已从肿柄菊中分离得到了以倍半萜和黄酮类化合物为主的100多个化合物，同时还发现其叶的水提物具有显著的大鼠体内降血脂活性〔15〕，这与本研究肿柄菊地上部分醇提物具有较好的体外降脂活性结果一致。研究还表明，肿柄菊的降脂活性物质基础可能并非其主成分，而是皂苷类成分〔15〕。狼杷草主要含黄酮类化合物，其次为聚炔类特征成分〔16〕。根据现有的研究报道，黄酮类成分多通过干扰脂质吸收和合成、诱导脂质代谢等发挥降脂活性〔17〕，因此推测其可能为狼杷草的降脂物质基础。熊胆草的主要成分为齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，此外还含有黄酮、二萜及其糖苷类等成分〔18〕，降脂成分为皂苷类还是黄酮类化合物，有待进一步验证。紫茎泽兰主要含暂未见降脂活性报道的杜松烷型倍半萜类化合物，其次为绿原酸衍生物，以及少量黄酮等其他成分〔19〕，故其降脂活性成分和机制还有待深入研究。

本研究中体外降脂活性较好的黄花蒿、野艾蒿同属植物猪毛蒿Artemisia capillaris水提物具有较好的大鼠体内降脂活性〔20〕；鬼针草、狼杷草同属植物Bidens odorata乙醇提取物及其中糖苷类化合物具有较好的小鼠体内降脂活性〔21〕；推测菊科蒿属和鬼针草属植物的降脂活性可能较同科其他属植物强，并在一定程度上具有普遍性。本研究筛选出12种植物具有较好的降脂活性（降脂率大于10%），然而仅肿柄菊有降脂活性报道，提示这些菊科植物具有较大的后续深入研究价值和潜力。此外，豨莶和云南蒿等植物出现降脂率为负数情况，镜检发现，这些植物可能具有一定的促进脂质堆积或促进细胞增殖作用，抑或两种作用同时存在。