白族药用植物鞍叶羊蹄甲对小鼠的急性毒性研究

陈亚男，石少敏，付 姿，刘汉福，姜 北，，沈 磊，*

（1.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室（培育），云南大理 671000；2.大理大学药学院，云南大理 671000）

鞍叶羊蹄甲Bauhinia brachycarpaBenth.，又名马蹄叶、大叶羊蹄甲、马蹄飞等，属于豆科羊蹄甲属植物，全国多地均有分布，以云南分布最广，为白族的一种民间用药。白族用药记载鞍叶羊蹄甲可抗炎、疏通经络、治疗筋骨疼痛等〔1〕。课题组前期对84种滇西药用植物进行筛选时发现鞍叶羊蹄甲对醋酸诱导的外周炎性疼痛的镇痛活性最为显著，对热板所致的中枢性疼痛也有明显镇痛作用，可作为镇痛药使用〔2〕。目前主流的镇痛药疗效肯定，但是不良反应较多，有的甚至还有成瘾性〔3〕。镇痛药多具有中枢系统的不良反应，如中枢抑制、运动协调能力失衡、肌无力等〔4〕。鞍叶羊蹄甲可以作为镇痛药使用，但目前尚无报道研究其用药安全性。因此，本研究拟探讨鞍叶羊蹄甲的急性毒性，并主要观察其对中枢系统的影响，为鞍叶羊蹄甲的安全用药提供依据。

1 材料与仪器

1.1 动物SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。动物实验完全依照大理大学实验动物管理委员会的相关规定进行。

1.2 药物与试剂鞍叶羊蹄甲于2019年8月采自大理漾濞，由大理大学药学院生药教研室张德全教授鉴定为豆科羊蹄甲属植物鞍叶羊蹄甲B.brachycarpaBenth.，经95%乙醇提取为粗提物后制成冻干粉，实验时用0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）制成混悬液供灌胃使用。水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：Q/12HB 4218-2017）；CMC-Na（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080523）；4%组织细胞固定液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20200831）。

1.3 仪器ZZ-6型小鼠自主活动仪、ZB-200型疲劳转棒仪（成都泰盟科技有限公司）；全自动动物血液细胞分析仪（南京普朗医疗设备有限公司）。

2 方法

2.1 预实验 对鞍叶羊蹄甲粗提物的溶解度进行测试，发现20 g/kg为0.5%CMC-Na所能溶解粗提物的最大剂量。取昆明种小鼠36只，按体质量随机分为6组，每组6只，分别为溶剂对照组，鞍叶羊蹄甲粗提物20.0、13.3、8.9、5.9、3.9 g/kg 5个剂量组，剂间比为1∶1.5。实验前12 h禁食不禁水，然后灌胃不同剂量的粗提物，溶剂对照组灌胃0.5%CMCNa，灌胃体积均为40 mL/kg，仅灌胃1次。灌胃后连续观察14 d，期间称量小鼠体质量，同时观察小鼠行为学表现。给药后第14天，脱臼处死小鼠，取脏器，观察有无病变。结果发现，与溶剂对照组比较，给予所有剂量的鞍叶羊蹄甲粗提物后，均未发现小鼠死亡，小鼠的体质量、行为学及脏器均无异常。因此，拟采用最大给药量法进行正式实验。

2.2 正式实验

2.2.1 分组及给药 取昆明种小鼠40只，雌雄各半，按行为学数据和体质量随机分为2组，每组20只，分别为溶剂对照组和鞍叶羊蹄甲组。以40 mL/kg的最大给药体积分别给溶剂对照组小鼠和鞍叶羊蹄甲组小鼠灌胃0.5%CMC-Na和20 g/kg的鞍叶羊蹄甲粗提物，仅灌胃1次，灌胃后连续观察小鼠反应14 d。

2.2.2 指标测定 观察并记录动物的毒性反应，包括外观体征，行为活动，精神状态，食欲，大小便及颜色，被毛，肤色，呼吸及鼻、眼、口腔、生殖器等有无异常分泌物等。于给药前1 d，给药后1、2、3、5、8、11、14 d称量小鼠体质量，并同时测试小鼠的行为学表现。行为学实验具体为：（1）于自主活动仪记录小鼠的“站立”次数（平行测2次取平均值）以反应小鼠自主活动次数。（2）于平衡木上测试小鼠通过平衡木的表现以反应小鼠的运动协调能力，评分标准：平稳通过，1分；前肢或后肢滑落，2分；悬挂或抱住平衡木，3分；直接掉落，4分。（3）于疲劳转棒仪记录小鼠在转棒仪（30 r/min）上的停留时间以反应小鼠的抗疲劳能力。给药14 d后，眼后静脉丛取血，通过全自动动物血液细胞分析仪测定血液生化指标，然后脱臼处死小鼠，取脏器称量，计算脏器指数：脏器指数（%）=脏器质量/体质量×100%；并取肝、肾、心、脑组织放入4%多聚甲醛中固定后送大理白族自治州人民医院病理科进行苏木精-伊红（HE）染色，观察组织病理学变化。

2.3 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行数据处理，数据用（x±s）表示。计量资料用LSD法比较组间差异；计数资料用非参数秩和检验比较组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 鞍叶羊蹄甲对小鼠体质量和一般表现的影响给予鞍叶羊蹄甲后，小鼠的一般表现，包括外观、饮食、活动表现、分泌物等未见异常。与溶剂对照组相比，除了在给药第14天鞍叶羊蹄甲组小鼠体质量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），其余测量时间点鞍叶羊蹄甲组小鼠的体质量均无显著变化，说明鞍叶羊蹄甲对小鼠体质量基本无影响。见表1。

表1 鞍叶羊蹄甲对小鼠体质量的影响（x±s，n=20）

3.2 鞍叶羊蹄甲对小鼠行为学的影响本实验检测的小鼠行为学主要包括自主活动、运动协调能力和抗疲劳能力，分别用自主活动次数、平衡木评分和在疲劳转棒仪上的停留时间评价。与溶剂对照组相比，给予鞍叶羊蹄甲1 d后，小鼠的自主活动次数显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05），其余检测时间点小鼠的自主活动次数无显著变化；小鼠的平衡木评分以及在疲劳转棒仪上的停留时间无显著差异。说明刚开始给予鞍叶羊蹄甲时会对小鼠的自主活动产生一定的抑制作用，除此外，鞍叶羊蹄甲不会对小鼠的行为学表现产生影响。见表2。

表2 鞍叶羊蹄甲对小鼠行为学的影响（x±s，n=20）

3.3 鞍叶羊蹄甲对小鼠脏器指数和主要血液生化指标的影响与溶剂对照组相比，鞍叶羊蹄甲组小鼠的脏器指数和主要血液生化指标差异均无统计学意义（P＞0.05），说明鞍叶羊蹄甲对小鼠的主要脏器和血液指标无明显影响。见表3～4。

表3 鞍叶羊蹄甲对小鼠脏器指数的影响（x±s，n=20）

3.4 鞍叶羊蹄甲对小鼠脏器组织的影响脏器组织切片HE染色结果见图1。与溶剂对照组相比，鞍叶羊蹄甲组小鼠的肝、肾、心、脑未见明显病理变化，进一步说明鞍叶羊蹄甲对小鼠脏器无明显毒副作用。

表4 鞍叶羊蹄甲对小鼠主要血液生化指标的影响（x±s，n=20）

图1 鞍叶羊蹄甲对小鼠脏器组织的影响（×400，标尺为50μm）

4 讨论

本研究通过预实验发现最大给药量的鞍叶羊蹄甲未造成小鼠死亡，因此采用最大给药量法评估鞍叶羊蹄甲对小鼠的急性毒性作用。结果表明：20 g/kg的鞍叶羊蹄甲基本没有急性毒性作用。首先，鞍叶羊蹄甲对小鼠的进食无明显影响，与溶剂对照组相比，仅在第14天时鞍叶羊蹄甲组小鼠体质量有所降低，其余时间段内体质量差异不明显。其次，鞍叶羊蹄甲对主要脏器无明显的毒副作用，无论是脏器指数还是脏器组织切片均未见显著变化。鞍叶羊蹄甲对主要的血液生化指标也没有明显的影响，说明其对小鼠的运送氧气功能、免疫功能无显著毒性，但要注意鞍叶羊蹄甲能一定程度地升高小鼠的血小板计数，尽管差异无统计学意义，还是需要在用药后密切注意其可能的促血栓作用〔5〕。由于鞍叶羊蹄甲可能通过外周抗炎起镇痛作用，其与非甾体抗炎药对血小板的作用也需要做一定的比较。鞍叶羊蹄甲对于其余急性毒性指标，如外观、活动、分泌物排泄等均没有明显影响，说明鞍叶羊蹄甲的安全性较高，对动物的主要脏器功能均相对安全。

镇痛药物普遍存在中枢毒性〔6〕，如阿片类药物引起镇静、眩晕、肌肉痉挛、恶心呕吐和成瘾；非阿片类镇痛药物曲马多引起中枢抑制和无力；治疗胃肠绞痛的阿托品引起中枢兴奋及随后的中枢抑制；治疗神经痛药物卡马西平引起眩晕、共济失调等。鞍叶羊蹄甲对中枢性疼痛也有一定的作用。因此，本研究着重考察了鞍叶羊蹄甲对中枢系统的影响，采用自主活动仪、平衡木和疲劳转棒仪评价用药后小鼠的自主活动、运动协调和平衡能力、抗疲劳和平衡控制能力。结果表明，鞍叶羊蹄甲不会影响小鼠的运动协调、平衡控制和抗疲劳能力，但是在用药后第1天小鼠的自主活动次数显著减少，并在观察期间小鼠的自主活动均降低，说明鞍叶羊蹄甲有一定的中枢抑制效应，需要在用药期间注意监控。

20 g/kg的鞍叶羊蹄甲换算为成年人（60 kg）的用量约为1 320 g生药（按小鼠剂量折算系数为1，人剂量系数折算为0.11〔7〕31，生药到冻干粉提取率为10%计算），在实际用药中无法达到，因此，总体而言，治疗剂量的鞍叶羊蹄甲（长期毒性实验的低剂量一般设计为最大耐受量的1/10〔7〕112，这里假定治疗量为最大耐受量的1/20，即1 g/kg）基本无急性毒性。由于鞍叶羊蹄甲主要用于慢性疼痛，如炎性疼痛和神经痛，其长期毒性需要进一步的研究来评估。