2-氨基苯并咪唑衍生物的合成及抑菌活性初步研究

冯宇喆，代文哲，刘根炎，巨修练

(武汉工程大学 化工与制药学院，湖北武汉 430205)

农药是保障粮食丰产的有效手段之一，开发更加安全、高效、经济和使用方便的产品成为当今农药发展的主要方向。随着全球人口数量的不断增加，对粮食及果蔬的需求也随之增长，加之地球变暖，导致各种病原菌的危害愈来愈突出，因此，对杀菌剂的需求也不断增加。苯并咪唑类化合物由于其自身的优良特性，在材料、生物、医药、农药等领域均有广泛应用[1-3]。该类化合物在杀菌剂中占有重要地位，主要品种有多菌灵、丙硫多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、麦穗宁等，具有广泛的杀菌活性，在防治农作物、水果、蔬菜、棉花等的病害防治方面发挥着重要作用[4-6]。

灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)寄主范围广，具有繁殖速度快、产孢量大、遗传变异大和适合度高等特点，可以引起番茄、黄瓜、草莓等蔬果及花卉发生灰霉病，极大地影响了蔬菜瓜果的产量[7-9]。近年来，灰霉病以化学防治为主，目前普遍使用的药剂品种有多菌灵、苯菌灵、速克灵等。由于部分杀菌剂的广泛长期单一使用，导致病原菌对这些药剂产生了抗性，防治效果降低了，农用成本增加了[10-12]，因此，开发新型对灰霉病病原菌具有较好防治效果的杀菌剂具有重要意义。

在总结文献的基础上，本研究采用了多菌灵和苯菌灵的公共骨架结构(2-氨基苯并咪唑)作为所设计化合物的骨架，在参考了敌菌灵结构中芳环取代的特点后，利用活性基团拼合等原理，设计并合成了2-N-取代苄基苯并咪唑类化合物(图1)。合成路线以2-氨基苯并咪唑为起始原料，与不同取代的芳醛反应生成中间体N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亚胺，然后还原得到目标产物[13-17]。并初步测定了12个目标产物对灰霉病病原菌的抑制活性。

图1 目标化合物的设计

图2 目标化合物的合成路线

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

RY-1型熔点仪(温度计未校正，天津天分分析仪器厂)；Varian Mercury-VX 400型核磁共振仪(美国瓦里安公司)；Thermo LTQ XL液质联用质谱仪(美国热电公司)。试验中所使用的主要试剂：2-氨基苯并咪唑、3-甲基苯甲醛、4-甲基苯甲醛、3-氟苯甲醛、4-氟苯甲醛、3-氯苯甲醛、4-氯苯甲醛、3-溴苯甲醛、4-溴苯甲醛、3,4-二氯苯甲醛、2,4-二氯苯甲醛、3,5-二氯苯甲醛、2,4-二氯苯甲醛(均为化学纯，国药集团)，除特别注明外，均未经进一步处理直接使用。

1.2 合成方法

1.2.1 目标化合物N-(3-甲基苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(1)的合成

将2-氨基苯并咪唑1.50 g(11.27 mmol)及3-甲基苯甲醛1.37 g (11.42 mmol)加入到100 mL的单口瓶中，然后加入氯化锌80 mg，量取45 mL无水甲醇加入到上述反应瓶中搅拌溶解。将反应液升温至回流，TLC检测跟踪反应进程，石油醚∶乙酸乙酯=1∶1 (体积比)为展开剂。在反应过程中，发现反应溶液由无色逐渐变为黄色，经TLC检测，有新点产生，反应11 h后，发现反应难以进行完全。停止加热，将反应溶液冷却至室温，旋转蒸发脱溶，得到黄色固体2.95 g。将上述黄色固体用6 mL乙酸乙酯溶解，加入适量硅胶拌匀，采用300～400目的硅胶进行柱层析，洗脱剂：石油醚∶乙酸乙酯=5∶1 (体积比)，收集仅含有产物点的洗脱液，旋转蒸发脱溶，最后得到中间体N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亚胺，黄色固体0.757 g，产率29%。称取上述中间体N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亚胺600 mg (2.55 mmol)、硼氢化钠308 mg (7.65 mmol)，量取甲醇30 mL一并加入到100 mL单口瓶中，常温搅拌。搅拌过程中不断有少量的气体放出，溶液由黄色逐渐变为无色。反应3 h后，TLC检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯=1∶2 (体积比)，反应完毕，此时溶液颜色为粉红色。旋转蒸发脱溶后，加入50 mL乙酸乙酯溶解，用30 mL饱和食盐水洗涤。然后将有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液旋蒸除去溶剂，所得到的固体经柱层析纯化，洗脱剂：石油醚∶乙酸乙酯=5∶1 (体积比)，得到淡黄色固体0.331 g。产率 55%，mp：139～143 ℃。1H NMR(DMSO, 400 MHz)，δ：2.28 (s, 3H, CH3)，4.48 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.85～7.18 (m, 9H, ArH)，10.80 (s, 1H,NH)。MS (ESI)：238 (M+1)+。

1.2.2 目标化合物N-(4-甲基苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(2)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(4-甲基苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(2)，白色固体，产率88%，mp：175～178 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：2.26 (s, 3H, CH3)，4.46 (d, 2H,J=8.0 Hz,CH2)，6.84～7.27 (m, 9H, ArH)，10.79 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：238 (M+1)+。

1.2.3 目标化合物N-(3-氟苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(3)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(3-氟苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(3)，淡黄色固体，产率83%。mp：134～136 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.54 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.86～7.39(m, 9H, ArH)，10.88 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：242(M+1)+。

1.2.4 目标化合物N-(4-氟苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(4)的合成

参照1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(4-氟苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(4)，淡黄色固体，产率76%，mp：166～169 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.49 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.85～7.43 (m, 9H, ArH)，10.83 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：242 (M+1)+。

1.2.5 目标化合物N-(3-氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(5)的合成

参照1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(3-氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(5)，淡黄色固体，产率78%，mp：160～164 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.52 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.85～7.43 (m, 9H, ArH)，10.89 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：258 (M+1)+。

1.2.6 目标化合物N-(4-氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(6)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(4-氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(6)，白色固体，产率78%，mp：169～174 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.50 (d, 2H,J=4.0 Hz, CH2)，6.79～7.41 (m, 9H,ArH)，10.86 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：258 (M+1)+。

1.2.7 目标化合物N-(3-溴苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(7)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(3-溴苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(7)，白色固体，产率75%，mp：161～165 ℃。1H NMR (DMSO, 400 MHz)，δ：4.52 (d, 2H,J=4.0 Hz , CH2)，6.85～7.56 (m, 9H,ArH)，10.88 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：303 (M+1)+。

1.2.8 目标化合物N-(4-溴苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(8)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(4-溴苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(8)，白色固体，产率52%，mp：187～191 ℃。1H NMR (DMSO，400 MHz)，δ：4.48 (d, 2H,J=4.0 Hz，CH2)，6.84～7.52 (m,9H, ArH)，10.86 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：303 (M+1)+。

1.2.9 目标化合物N-(3,4-二氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(9)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(3,4-二氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(9)，白色固体，产率73%，mp：212～216 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.51 (d, 2H,J=8.0 Hz , CH2)，6.85～7.61(m, 8H, ArH)，10.89 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：293(M+1)+。

1.2.10 目标化合物N-(2,4-二氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(10)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(2,4-二氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(10)，白色固体，产率 64%，mp：193～197 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.56 (d, 2H,J=4.0 Hz , CH2)，6.87～7.61 (m,8H, ArH)，10.90 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：293 (M+1)+。

1.2.11 目标化合物N-(3,5-二氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(11)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(3,5-二氯苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(11)，白色固体，产率 60%，mp：156～160 ℃。1H NMR (DMSO,400 MHz)，δ：4.53 (d, 2H,J=4.0 Hz, CH2)，6.86～7.46(m, 8H, ArH)，10.93 (s, 1H, NH)。MS (ESI)：293(M+1)+。

1.2.12 目标化合物N-(2,4-二羟基苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(12)的合成

参照 1.2.1节目标化合物(1)的合成方法得到N-(2,4-二羟基苄基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(12)，白色固体，产率 71%，mp：146～150 ℃。1H NMR(DMSO, 400 MHz)，δ：4.49 (d, 2H,J=8.0 Hz, CH2)，6.19～7.28 (8H, ArH)，9.12 (s, 1H, OH)，10.94 (s, 1H,NH)，11.76 (s, 1H, OH)。MS (ESI)：256 (M+1)+。

1.3 活性测定

1.3.1 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯20 g，琼脂20 g，葡萄糖20 g，灭菌蒸馏水1 000 mL。

1.3.2 试验菌种

灰霉病病原菌(Botrytis cinerea)，南京农业大学提供。

1.3.3 目标化合物对病原菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法[18]测定目标化合物对灰霉病病原菌菌丝的生长抑制作用。将每个目标化合物均用丙酮配制成0.5、5、50 μg/mL的待测溶液，测定其对灰霉病病原菌的抑制活性。在无菌操作台上，用移液枪取 1 mL配制好的样品溶液分别加入到培养皿中，用丙酮作空白对照，然后用无菌玻璃注射器注射9 mL融化好的培养基，使药液与培养基充分混合均匀，放置并冷却到室温。然后在培养皿中间位置接种病原菌，每个处理重复3次，最后将培养皿放入28 ℃的恒温培养箱中进行培养。培养3 d后，利用十字交叉法测出菌落直径，计算直径的平均值。最后根据菌落的平均直径计算抑菌率[19]。

按照以上方法测定所合成的 12个目标化合物的抑菌率。

2 结果与讨论

目标化合物1-l2对灰霉病病原菌的活性测试结果如表1所示。

表1 目标化合物1-l2对灰霉病病原菌的抑菌率(%)

续表1

从表1可以看出，浓度在50 μg/mL时，所有化合物对灰霉病病原菌均有一定的抑制活性。2-氨基苯并咪唑衍生物中N取代苄基苯环对位溴取代的化合物8活性最低，抑菌率为30%；苯环甲基取代的化合物1和2活性相对较低，分别为37%和31%；苯环氯取代的化合物5和6的抑菌活性相近，分别为 46%和 50%；在苯环二氯取代化合物中，3,4-位二取代的化合物 9的抑菌活性分别高于 2,4-位和3,5-位取代化合物10和11的抑菌活性。化合物4、7、9的抑菌活性超过50%，化合物9活性最高达到60%，这些化合物可以进一步详细研究。

3 结 语

本研究针对2-氨基苯并咪唑的结构特点，利用活性结构拼合的原理，设计、合成了一类2-氨基苯并咪唑衍生物。以2-氨基苯并咪唑为起始原料，与不同取代的芳醛反应生成中间体N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1-取代苯基甲亚胺，然后用硼氢化钠还原得到12个目标产物。该合成方法原料易得，反应条件容易控制，所有合成的目标化合物经1H NMR及MS表征确认。通过菌落直径法初步研究了该类化合物对灰霉病病原菌的抑菌活性，结果表明所有目标化合物在50 μg/mL时对灰霉病病原菌具有一定的抑菌活性，化合物4、7、9的抑菌活性超过50%，化合物9活性最高达到60%。以上这些化合物可以进一步衍生化，进行结构与活性关系研究，希望开发出对灰霉病病原菌具有较高活性的新化合物。