不同产区陈酿干红葡萄酒花色苷与颜色相关性分析

吴璐璐，范舒悦，张煜，李运奎,2*

（1. 西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；2. 西北农林科技大学宁夏贺兰山东麓葡萄酒试验示范站，宁夏闽宁 750104）

颜色是葡萄酒感官质量和内在质量的重要组成部分，能够最直观地反映出葡萄酒的类型、品质、贮存性甚至营养价值等信息，颜色纯正、亮丽、稳定的葡萄酒会更加受到消费者青睐[1-2]。在葡萄酒酿造工艺优化、过程质量控制、感官品评分析、产区和品种特色认定等方面，颜色都发挥着不可忽视的作用。目前，关于葡萄酒颜色主要集中在影响因素研究[3-7]、颜色特征表征与评价研究[8-11]、颜色基础物质分析研究[12]和颜色演化规律研究[13-14]等方面。尤其是颜色影响因素的研究受到了较多关注，如葡萄品种、栽培与管理措施、原料成熟度状况、酿造工艺、陈酿条件、花色苷与无色多酚等关键成分、pH等。

花色苷（anthocyanin）是红葡萄酒颜色的物质基础，Han等人[15]采用主成分回归分析法研究了新酿‘赤霞珠’葡萄酒中花色苷与颜色的关系，发现参与分析的花色苷可以解释葡萄酒红色的64.56%～81.57%，其他研究者也得到了类似的结论[16]。一般来说，以上因素对红葡萄酒呈色的影响都需通过影响花色苷的组成、含量或存在形式等才能实现[17-18]。在欧亚种年轻红葡萄酒中，花色苷主要以单体形式存在，包括5种基本花色苷（非酰化花色苷）：花翠素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside,Dnd-G）、花青素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside,Cnd-G）、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside, Ptnd-G）、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside, Pnd-G）和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside, Mvd-G），及其与乙酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等形成的酰化花色苷[12-13]。通常年轻红葡萄酒中基本花色苷含量略高于酰化花色苷，聚合花色苷含量很低[13]，Cnd-G和Pnd-G主要贡献橘黄色色调，Dnd-G、Ptnd-G和Mvd-G主要贡献紫红色色调，酰化花色苷对颜色的贡献可能大于非酰化花色苷[12]。随着陈酿的进行，单体花色苷倾向于与乙醛、丙酮、咖啡酸等酸类、4-乙烯基儿茶酚等酚类、以及黄烷醇类物质反应，生成结构更复杂、活性更低、更稳定的聚合花色苷（如吡喃花色苷）[14]。聚合花色苷的生成使酒体颜色更稳定，但黄色色调却占据更大比例，因为吡喃花色苷主要贡献橙红或橘黄色调，其他聚合花色苷贡献橙黄、紫红或蓝色色调[12]。可见，深入研究红葡萄酒的颜色特征及其与花色苷种类和含量的关系，对生产具有更高颜色品质的红葡萄酒意义重大。

目前对国内红葡萄酒颜色特征及花色苷影响的研究报道较少。相关报道往往只涉及少数产区[19]，并以研究年轻红葡萄酒为主[8,13,20]。本研究选取国内10个产区（子产区）的陈酿‘赤霞珠’干红葡萄酒，及山东产区的陈酿‘赤霞珠’‘蛇龙珠’‘品丽珠’和‘美乐’干红葡萄酒，采用红葡萄酒颜色特征的直观表征法[21]和相关统计分析方法，分析我国多产区、多品种的陈酿红葡萄酒颜色特征及与花色苷的相关关系，以期为相关研究和生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以云南、新疆、甘肃、宁夏、河北、陕西和山东产区共10款‘赤霞珠’干红葡萄酒。具体产地：1#-云南迪庆；2#-新疆和硕；3#-甘肃嘉峪关；4#-宁夏玉泉营；5#-河北昌黎；6#-河北沙城；7#-陕西咸阳；8#-山东烟台；9#-甘肃武威；10#-新疆五家渠；11#～13#为山东产区‘蛇龙珠’‘品丽珠’和‘美乐’干红葡萄酒。所有酒样均为2015年份压榨，不锈钢罐储存。

酒石酸钾钠、硫酸铜、葡萄糖、氢氧化钠、碘、碘化钾、氯化钾、盐酸、三水醋酸钠、醋酸、硫酸、淀粉、邻苯二甲酸氢钾、酚酞与亚甲基蓝等药品均为分析纯，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。乙腈、甲醇、甲酸购自广州市金华大化学试剂有限公司，均为色谱纯。标准样品Mvd-G购自Sigma公司。实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

日本岛津公司UV-1750紫外可见分光光度计、LC-10Avp高效液相色谱仪；芯硅谷一次性无菌针式过滤器及0.45 μm微孔滤膜由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.3 方法

去离子水做参比，将葡萄酒样品经0.45 μm滤膜过滤后，采用2 mm光程玻璃比色皿，用UV-1750紫外可见分光光度计扫描酒样在可见光区400～780 nm内的吸收光谱，间隔1 nm，每酒样重复3次。CIELAB参数计算选用10°观察者视场，D65标准白光源[8,22]，将吸收光谱中450、520、570、630 nm波长处的吸光度值校正到1 cm光程后，参考文献21中的方法计算参数L*、a*、b*、和hab。采用红葡萄酒颜色特征的直观表征法表征供试酒样颜色特征[21]。首先，在CIELAB颜色空间中，取L*＝60，构建二维高清彩度平面（a*＝0～60,b*＝0～60），将供试酒样的a*和b*参数投影到该平面上，得到酒样颜色的彩度分布图。其次，根据L*值，在一维的明度图上标记出各供试酒样，得到酒样颜色明度分布情况。最后，综合考虑L*、a*和b*三个参数对颜色的贡献，在明度图上将各酒样渲染上相应的颜色，即得到酒样的特征颜色图，表征在自然观察条件下酒体所呈现的颜色。

采用pH示差法（化学法）测定总花色苷含量，方法详见文献8。采用高效液相色谱（HPLC）法测定总花色苷和单体花色苷组成与含量[23]。以Mvd-G标准样品绘制标准曲线：y＝61370x－20641，其中y为峰面积，x为标准溶液质量浓度，R2＝0.9999。根据文献得出Dnd-G、Cnd-G、Ptnd-G、Pnd-G和Mvd-G5种基本花色苷；甲基花青素-3-O-乙酰葡萄糖苷（peonidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside，Pnd-AG）、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷（malvidin-3-O-(6-O-acetyl)-glucoside，Mvd-AG）、甲基花青素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷（peonidin-3-O-(6-O-caffeoуl)-glucoside，Pnd-CG）和二甲花翠素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷（malvidin-3-O-(6-O-caffeoyl)-glucoside，Mvd-CG）4种酰化花色苷的出峰顺序，定性确定该9种单体花色苷，并进一步根据标准曲线方程对各花色苷含量进行定量分析。相关色谱条件及详细方法参考文献23。

1.4 数据处理

使用OriginPro 8、IBM SPSS Statistics 22以及Fireworks 8完成吸收光谱绘制、数据统计分析、高清CIELAB色空间彩度和明度分布图以及葡萄酒特征颜色图绘制。

2 结果与分析

2.1 颜色特征分析

基于CIELAB色空间与可见吸收光谱，前期提出了采用彩度分布图、明度分布图和特征颜色图对红葡萄酒颜色特征进行直观表征[21]。将各酒样的a*和b*参数投影到L*＝60平面上即得彩度分布图（图1左），各投影点（酒样编号放置处）的颜色即代表该酒样只考虑a*和b*参数，且L*＝60时的颜色特征。彩度分布图清晰地呈现了各酒样a*和b*参数的相对大小，以及等参数的信息及彼此关系。各颜色投影点到原点的距离即为相应酒样的色度其所在直线与a*轴夹角即为色调hab，两颜色投影点间的距离代表该两种酒样颜色的总色差距离越大，总色差越大。在一维明度坐标轴上，依据L*大小排列酒样位置（以带编号的圆斑表示酒样），得到酒样颜色的明度分布图（图1右）。进一步综合考虑L*、a*和b*三参数对颜色的贡献，使各圆斑渲染上相应的颜色，即得各酒样的特征颜色图（图1右）。特征颜色表征酒样在自然观察条件下（自然白光、10°观察视角）酒体所呈现的宏观颜色；彩度分布和明度分布图则从正交的L*、a*和b*三因素剖析了宏观颜色的成因，尤其是颜色差异的来源。

图1 供试酒样CIELAB彩度分布图（左）、明度分布与特征颜色图（右）Figure 1 Colorfulness distribution (left), lightness distribution and feature color (right) of thirteen wine samples

由图1可见，供试酒样红色分量a*较大，最大与最小者分别为4#和10#酒样，但彼此间分布较集中，差异较小。黄色分量b*分布分散，酒样间差异较大，4#酒样的b*最大；10#酒样的b*最小。较大的b*差异导致了较大的色度和色调差异。4#酒样色度最高，色调角最大，呈橙红色，黄色色调贡献明显；10#酒样色度最低，色调角最小，呈明显的紫红色，黄色色调贡献弱。在不考虑明度差异的情况下，4#与10#酒样由于距离最远，总色差最大。1#～10#不同产区的酒样间特征颜色差异明显，a*差异较小，b*、差异都较大，说明产地因素及相关酿造工艺的差异导致了酒样间颜色的显著差异，且黄色色调对颜色的贡献很大。8#和11#～13#同产区不同品种酒样间特征颜色存在差异，a*差异较小，b*、差异都较大，说明品种因素及相关酿造工艺的差异导致了酒样间颜色的显著差异，且黄色色调对颜色的贡献很大。对比来看，产地因素对葡萄酒颜色差异的贡献可能大于品种因素。这也可以通过供试酒样可见吸收光谱加以印证，如图2。各吸收光谱曲线的总体趋势一致，升降幅度接近，且8#和11#～13#酒样分布较1#～10#酒样更集中。

图2 酒样在可见光区的吸收光谱图Figure 2 Visible absorption spectra of thirteen wine samples

2.2 花色苷组成与含量

如图3所示，化学法和HPLC法测定供试酒样总花色苷含量分别为17.9～154.2、22.7～114.0 mg·L-1。对各酒样来说，虽然两种方法测定的绝对含量存在差别，但酒样间相对含量大小趋势一致，4#酒样含量最低，10#酒样含量最高。

图3给出了HPLC法测定的总花色苷组成情况，包括Dnd-G、Cnd-G、Ptnd-G、Pnd-G、Mvd-G、Pnd-AG、Mvd-AG、Pnd-CG和Mvd-CG 9种单体花色苷总含量及其他酰化花色苷和聚合花色苷。9种单体花色苷含量在6.1～75.1 mg·L-1，4#酒样含量最低，10#酒样含量最高；9种单体花色苷占总花色苷含量的16.75%～65.88%，4#、8#和12#占比都较低，10#最高。另外，其他酰化花色苷和聚合花色苷含量在16.6～42.2 mg·L-1，占总花色苷的34.12%～83.25%，部分酒样甚至高于9种单体花色苷的含量。

图3 化学法（左）与HPLC法（右）测定的总花色苷含量Figure 3 Total anthocyanins content of thirteen wine samples by chemical analysis (left) and HPLC analysis (right)

9种单体花色苷的组成与含量见表1，各酒样分布轮廓基本一致，Mvd-G是含量最高的花色苷，占9种单体花色苷含量的40.66%～61.89%，占总花色苷含量（HPLC法）的6.77%～31.23%；Mvd-AG一般是含量最高的酰化花色苷，占9种单体花色苷含量的8.02%～23.77%。Dnd-G、Cnd-G、Ptnd-G、Pnd-G和Mvd-G 5种基本花色苷含量在4.33～51.67 mg·L-1，占9种单体花色苷含量的61.42%～84.32%，占总花色苷含量的10.21%～51.12%；其余4种酰化花色苷含量在1.70～23.39 mg·L-1，占9种单体花色苷含量的15.68%～38.58%，占总花色苷含量的6.42%～20.52%。

表1 供试酒样单体花色苷组成与含量Table 1 The content and composition of monomeric anthocyanins of thirteen wine samples mg·L-1

2.3 红葡萄酒花色苷与颜色特征的相关性

花色苷是红葡萄酒呈色的物质基础，为了探究供试酒样颜色特征与花色苷含量的关系，将表征颜色特征的参数和hab，表征可见吸收光谱特征的参数A520（酒样在520 nm处吸光度值，1 cm光程，下同）和ΔA（酒样在520 nm与450 nm处吸光度值之差）[21]，与化学法和HPLC法测定的总花色苷含量、9种单体花色苷含量，及其他酰化和聚合花色苷含量进行Pearson相关分析，结果见表2。化学法测定的总花色苷含量与b*和hab在P≤0.05水平显著相关，与其他颜色参数未表现出显著相关性；HPLC法测定的总花色苷与5个颜色参数在P≤0.05水平都表现出相关性，且与b*和hab在P≤0.01水平呈极显著相关。总花色苷与可见吸收光谱的特征参数A520和ΔA也存在显著或极显著相关性。可见，总花色苷含量对供试酒样颜色影响重大，尤其对黄色色调b*和色调角hab影响更为明显。

表2 CIELAB参数、吸收光谱和花色苷含量的相关性分析①Table. 2 Pearson correlation analysis between CIELAB parameters, absorption spectra and anthocyanins of thirteen wine samples

将HPLC法测定的总花色苷拆分为两项：9种单体花色苷和其他花色苷（包括其他酰化和聚合花色苷），并分析其与颜色参数和可见吸收光谱参数间相关性。如表3所示，9种单体花色苷与hab显著相关，与ΔA极显著相关；其他花色苷则与5个颜色参数以及A520呈现显著或极显著相关。这说明9种单体花色苷对供试酒样呈色依然有影响，但较年轻红葡萄酒中弱[13,24-25]；其他酰化花色苷和聚合花色苷则是供试酒样颜色的决定因素。

表3 CIELAB参数、吸收光谱和各单体花色苷含量的相关性分析Table 3 Pearson correlation analysis between CIELAB parameters, absorption spectra and monomeric anthocyanins

9种单体花色苷与颜色参数和可见吸收光谱参数间的Pearson相关分析表明，Dnd-G与所有颜色参数和可见吸收光谱参数无显著相关性；Cnd-G和Ptnd-G都只与ΔA显著相关；Pnd-G与L*、b*、显著相关，与hab和ΔA极显著相关；Mvd-G只与hab显著相关，与ΔA极显著相关；Pnd-AG与a*、b*、和hab显著相关，与ΔA极显著相关；Mvd-AG与b*、hab和ΔA显著相关；Pnd-CG与b*、hab、A520和ΔA显著相关；Mvd-CG与L*、b*、和ΔA显著相关，与hab和A520极显著相关。

3 讨论与结论

花色苷是干红葡萄酒中的重要多酚成分，与葡萄酒的呈色和口感等感官性质密切相关。在年轻干红葡萄酒中，花色苷主要以简单花色苷和酰化花色苷等单体形态存在，并对年轻干红葡萄酒的呈色产生重要贡献[25]。这些形态的花色苷化学性质活泼，易发生降解或聚合等转化，致使在陈酿过程中一方面花色苷含量明显降低，另一方面花色苷主要以聚合等形态存在，稳定性较高，对呈色产生持续贡献[12]。

对我国10个产区、4个品种共13款陈酿干红葡萄酒的花色苷组成分析表明，总花色苷含量为22.7～114.0 mg·L-1。总花色苷含量受产区和品种因素影响显著，新疆的两款酒样总花色苷含量最高，宁夏的一款酒样总花色苷含量最低。当然，这是葡萄原料质量与酿造工艺等环节和因素的综合作用结果，并不能简单反应某一方面因素的优劣。从花色苷组成来看，9种单体花色苷含量一般低于聚合花色苷含量，5种基本花色苷含量高于4种酰化花色苷含量，单体花色苷中Mvd-G的占比最大。不同产区和不同品种酒样间的趋势较一致。张世杰[23]等对来自我国不同产区、不同年份和不同品种的45款干红葡萄酒样品的花色苷组成与含量进行了分析，李伟[14]等分析了贺兰山东麓贺兰晴雪酒庄10个年份的‘赤霞珠’干红葡萄酒花色苷组成与含量，均得出了与本研究类似的结果。

本研究基于CIELAB色空间，采用红葡萄酒颜色可视化表征法[21]，直观呈现了供试酒样的宏观颜色，并从L*、a*和b*三因素剖析颜色成因和差异的来源。结果显示，产地和品种都会对葡萄酒宏观呈色造成显著影响。从明暗程度来说，酒样间差异显著，其中宁夏玉泉营的酒样明度最高，新疆五家渠的酒样明度最低；从红色色调来说，供试酒样间差异较小；从黄色色调来说，酒样间差异显著，其中宁夏玉泉营的酒样黄色色调最重，新疆五家渠的酒样黄色色调最浅，山东产区的‘蛇龙珠’‘品丽珠’和‘美乐’三个品种间黄色色调差异很大。结合花色苷含量来看，红葡萄酒呈色品质与花色苷含量呈现出较好相关性，即花色苷含量越高，呈色质量越好（红色色调重，黄色色调浅）。这种相关性在其他研究中也得到了印证，如有报道发现游离花色苷含量在陈酿过程中迅速下降，其下降趋势与葡萄酒颜色“黄移”规律一致[14]。郭耀东[10]等发现总花色苷含量对红葡萄酒明亮度、红绿色调、黄蓝色调均有显著影响。Han等[19]发现呈现黄色色调的吡喃花色苷对4年酒龄的陈酿‘蛇龙珠’干红葡萄酒颜色贡献突出。从不同花色苷组成对酒样颜色的贡献来看，尽管Mvd-G和Mvd-AG是供试酒样中含量最高的基本花色苷和酰化花色苷，但对供试酒样颜色影响最大的基本花色苷是Pnd-G，影响最大的酰化花色苷是Mvd-CG和Pnd-AG。对比来看，4种酰化花色苷对供试酒样颜色影响较大，5种基本花色苷则只有Pnd-G影响较大，所以酰化花色苷对陈酿红葡萄酒颜色的贡献大于基本花色苷的贡献，这似乎与年轻红葡萄酒的情形相似[12,15]。郭耀东等[10]也发现，Pnd-G对明度和红色色调影响显著，Cnd-G则对红色色调影响显著。

综上，本研究主要结论为：（1）5年酒龄的陈酿型干红葡萄酒花色苷组成和含量与酒体呈色紧密相关。（2）酰化花色苷含量低于基本花色苷，但对颜色的贡献大于基本花色苷；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷是含量最高的单体花色苷，但甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-乙酰葡萄糖苷是对酒体颜色影响最大的单体花色苷。（3）产区、品种等因素首先影响花色苷的组成与含量，进而影响酒样宏观呈色，且对黄色色调的影响大于对红色色调的影响。