反相液相色谱法测定闽产千斤拔染料木苷及染料木素含量

江思思，颜宝玲，张 淼，黄泽豪，刘小芬

(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

中药材千斤拔别名一条根、竹结豆、钻地风、山豆根等，具有祛风除湿、消肿解毒等功效，在福建全省各地多有分布，以沿海较多[1]。《福建省中药饮片炮制规范》(2012 年版)中收载千斤拔为豆科植物千斤拔(Flemingia prostrata)和大叶千斤拔(Flemingia macrophylla)的干燥根[2]。其现行质量标准仅有性状、显微、薄层色谱鉴别等，缺少含量测定等分析内容。现代药学研究表明，黄酮类化合物是千斤拔的主要化学成分，染料木苷和染料木素是其大豆异黄酮类中2 种含量较高的主要成分[3—5]。因此，本文以闽产千斤拔作为试材，建立其染料木苷及染料木素含量测定的方法，对福建不同产地的千斤拔药材20 批样品进行测定，为其质量控制标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

千斤拔药材采自福建各地，共20 批次，经福建中医药大学药学院刘小芬副教授鉴定，S1～S16 为千斤拔的根，S17～S20 为大叶千斤拔的根(表1)。标本保存于福建中医药大学药学院标本室。不同产地千斤拔阴干，粉碎，过四号筛，备用。

表1 闽产千斤拔样品信息Table 1 Sample information of flemingiae radix produced in Fujian

1.2 仪器与试剂

Waters-e2695-2998 高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；BSA224S 万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；XS105 微量天平(梅特勒托利多集团)；KQ-500DE 数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)；TDL-40B 低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；Milli-Q Direct 8 超纯水机(Millipore 公司)；DFY-C-500 快速开盖万能高速粉碎机(大德中药机械有限公司)。染料木苷对照品(上海源叶生物，HPLC 级，含量≥98%，批号：A29J10L94211)；染料木素对照品(上海源叶生物，HPLC 级，含量≥98%，批号：H30A9Z69019)；乙腈(HPLC 级，德国默克有限公司)；磷酸(HPLC 级，上海麦克林)；Milli-Q Direct 8 超纯水系统处理的去离子水。

1.3 方法

1.3.1 混合对照品溶液制备

取染料木苷和染料木素对照品各5.0 mg，用无水甲醇制成0.2 mg·mL-1对照品储备溶液。取对照品储备溶液各1 mL，用无水甲醇定容至10 mL容量瓶，制成0.02 mg·mL-1染料木苷和染料木素混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液制备

根据相关文献[6]确定甲醇浓度、料液比、提取时间为因素，各因素设3 水平，设计L9(33)正交试验(表2)。取不同基原千斤拔(S16、S18)进行正交试验，得出最佳提取工艺，按最佳提取工艺试验验证3 次，RSD 均小于3%，表明该工艺稳定可行。

表2 千斤拔提取工艺正交试验因素及其水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

称取千斤拔粉末0.5 g，按正交试验最佳工艺提取，用离心机4000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.3.3 色谱条件

采用Atlantis T3 高效液相色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(时间梯度：0→10→50→60→110→1 20 min；浓度梯度：5%→15%→40%→60%→100%→5% A)，流速1.2 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量10 μL，采用DAD 检测器进行全波长扫描(210～800 nm)。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性关系考察

取对照品母液配制成0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 mg·mL-1标准溶液，分别取10 μL进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。染料木苷和染料木素的回归方程分别为y=41889839x-4134 (R2= 0.9991)、y=67377321x-9208 (R2=0.9992)，两成分均在 0～0.012 mg·mL-1浓度下线性关系良好。

1.4.2 精密度试验

取1.3.1 项下混合对照品溶液连续进样6 次，染料木苷和染料木素峰面积的RSD 分别为0.07%和0.2%，表明仪器精密度良好。

1.4.3 重复性试验

称取同一千斤拔样品(S16) 6 份，按1.3.2 项下方法平行制备供试品溶液，进样测得染料木苷和染料木素的RSD 分别为1.24%和2.76%，表明该方法重复性良好。

1.4.4 稳定性试验

取同一供试品溶液(样品S16)，分别于0、2、4、8、16、24 h 进样测定峰面积，染料木苷和染料木素峰面积的RSD 分别为2.17%和1.15%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

1.4.5 加样回收试验

称取已测两成分含量的千斤拔样品(S16) 0.5 g 共6份，精密加入等量染料木苷和染料木素对照品，按1.3.2项下方法平行制备供试溶液，进样测定，染料木苷和染料木素的平均回收率分别为102.6%和101.5%，RSD 为0.57%和0.86%，表明该方法准确度高。

2 结果与分析

2.1 提取工艺优化正交试验

以千斤拔药材的总峰面积作为评价指标，结果表明各因素对提取效果的影响程度为料液比(B)＞提取时间(A)＞甲醇浓度(C)；料液比(B)有显著影响(P＜0.05)，而甲醇浓度(A)、提取时间(C)无显著影响(P＞0.05) (表3、表4)。不同基原千斤拔最佳提取工艺略有不同，千斤拔以80%甲醇提取为好，大叶千斤拔以60%甲醇提取较优，二者最佳料液比和提取时间一致，分别为1:25 g·mL-1和45 min。通过正交试验优化千斤拔超声提取工艺：不同基原千斤拔按各自最佳百分浓度甲醇提取，料液比1:25 g·mL-1，超声提取45 min。

表3 千斤拔(S16)提取正交试验结果Table 3 Orthogonal test result of extraction from Flemingia prostrata (S16)

表4 大叶千斤拔(S18)正交试验结果Table 4 Orthogonal test result of extraction from Flemingia macrophylla (S18)

2.2 色谱条件

按1.3.3 色谱条件进样，染料木苷和染料木素的分离度均大于1.5，理论塔板数大于5000。采用DAD检测器对染料木苷对照品溶液和染料木素对照品溶液进行全波长扫描(210～800 nm)，结果发现染料木苷和染料木素分别在258.8 nm 和260 nm 处有最大吸收，同时供试品溶液在260 nm 处基线较平稳，杂质峰干扰较少，故选取260 nm 作为检测波长(图1、图2)。

图1 对照品溶液和样品溶液HPLC图Fig. 1 HPLC diagram of reference solution and sample solution

图2 染料木苷和染料木素的紫外吸收光谱图Fig. 2 UV absorption spectra of genistin and genistein

2.3 不同产地千斤拔染料木苷和染料木素含量测定

福建不同产地千斤拔的染料木苷和染料木素含量见表5。闽产千斤拔中染料木苷含量在0～0.119 mg·g-1之间，平均含量为0.018 mg·g-1；染料木素含量在0.065～0.17 mg·g-1之间，平均含量为0.115 mg·g-1。闽产千斤拔中染料木素含量较染料木苷高。染料木苷和染料木素可能通过糖基化和水解反应互相转化[7]，故应进一步比较二者的总量限度。二者总含量在0.039～0.281 mg·g-1之间，平均含量为0.133 mg·g-1，以该值下调20%则为0.1 mg·g-1，故建议拟定本品染料木苷和染料木素的总含量不低于0.1 mg·g-1。

表5 福建不同产地千斤拔染料木苷和染料木素含量Table 5 Contents of genistin and genistein in flemingiae radix from different habitats of Fujian province

不同产地千斤拔两成分总含量(同一产地取总含量平均值)由高到低依次是三明尤溪(0.161 mg·g-1)、福州平潭与龙岩上杭(0.154 mg·g-1)、莆田秀屿(0.137 mg·g-1)、漳州南靖(0.135 mg·g-1)、漳州东山(0.130 mg·g-1)、福州长乐(0.129 mg·g-1)、龙岩武平(0.123 mg·g-1)、漳州华安(0.109 mg·g-1)、泉州南安(0.039 mg·g-1)(表5)。从产地来看，三明尤溪所产的千斤拔质量最优，福州平潭和龙岩上杭次之，不同产地千斤拔中染料木苷和染料木素总含量差异较小，沿海和内陆没有明显差异，表明福建省内不同产地千斤拔药材质量水平较稳定。

本次收集的千斤拔药材有千斤拔和大叶千斤拔两个基原，其中千斤拔两种成分平均总含量为0.133 mg·g-1，大叶千斤拔两种成分平均总含量为0.131 mg·g-1，两者差异较小，由此可见多个地方标准将两个基原都收录作为药材千斤拔是合理的。本次收集的千斤拔药材有野生和栽培两个来源，其中S1～S10 为野生品、S11～S20 为栽培品。野生品两成分平均总含量为0.140 mg·g-1，栽培品两成分平均总含量为0.122 mg·g-1，表明野生品的质量略优于栽培品，野生资源可在资源保护的基础上，进一步合理开发利用。

2.4 聚类分析

采用组内连接聚类法分析20 批千斤拔样品两成分含量的相关性(图3)。聚类分析结果显示，以d=10 划分，20 批样品共聚为2 类。福州平潭产千斤拔(S4)两成分含量较高，被单独聚为一类，可能与该地千斤拔的生长环境有关；其他产地样品被聚为一类，表明福建不同产区千斤拔质量较稳定，差异不明显。

图3 闽产千斤拔20 批样品聚类分析Fig. 3 Cluster analysis on 20 batches of samples of flemingiae radix from Fujian

3 讨论

3.1 提取方法的确定

已有学者对千斤拔的提取方式进行考察，表明提取方法对提取效果有显著影响，综合比较，超声提取法更适合于千斤拔黄酮类成分提取[6,8—9]。吴拾保等[10]考察了水和不同浓度甲醇、乙醇对千斤拔黄酮类成分提取的影响，结果表明甲醇提取率最高。因此，本研究选用超声提取法并采用甲醇作为提取溶剂对供试品进行制备，通过正交试验对甲醇浓度、料液比和提取时间进行优选，最终确定超声提取千斤拔的最佳工艺。该方法快速简便易行，可操作性强，有利于样品的批量提取分析。

3.2 不同产地千斤拔药材染料木苷及染料木素含量差异

千斤拔药材产云南、四川、贵州、广西、广东、海南、江西、福建等地，主产区为广西、云南和福建[11]。本研究对福建10 个产地的20 批千斤拔药材中染料木素和染料木苷含量进行测定，结果表明，省内不同产地千斤拔药材两种成分含量差异较小，质量水平相对稳定。研究结果具有一定代表性，可为今后千斤拔地方质量标准修订提供依据。前人研究发现，不同产地千斤拔药材中染料木苷和染料木素含量差异显著，不同产区中以广西产千斤拔两成分总量最高，提示广西可能是千斤拔的适宜生长区[12—15]。但药材次生代谢产物的含量是动态变化的，产地的海拔、气候、土壤等条件，药材的生长年限、贮藏年限等均可能对千斤拔药材中次生代谢产物变化产生影响，因此值得进一步探究。