脂肪酸结合蛋白4在同型半胱氨酸致大鼠心肌细胞焦亡中的作用

董小艳，刘达越，徐灵博，顾铃毓，马胜超，杨安宁，杨勇，刘云，姜怡邓*

1宁夏医科大学基础医学院，银川 750004；2国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，银川750004；3宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，银川 750004；4宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；5宁夏回族自治区人民医院核医学科，银川 750004；6宁夏医科大学总医院放射科，银川 750004

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含硫氨基酸，在多种病理生理过程中发挥重要作用[1]。脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)为脂肪酸结合蛋白家族的成员，是一种将脂质代谢与炎症紧密联系起来的中间递质[2]，其作用体现在各种脂质代谢[3]和心血管疾病如动脉粥样硬化[4]中。研究发现，在毛细血管内皮细胞和心外膜脂肪组织中FABP4的表达升高可抑制心肌细胞收缩，使心脏收缩和舒张功能下降，影响心室重构，与心力衰竭和肥厚性心肌病等心脏疾病的产生和进展密切相关，是评估心脏疾病的一项潜在的独立危险因素[5]。有研究发现，FABP4过表达可引起心肌细胞损伤、肥大，而沉默FABP4后可激活PI3K/AKT信号通路，改善心肌细胞损伤情况[6]。焦亡是由炎性小体触发的炎症颗粒NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)释放到细胞外的细胞死亡。细胞焦亡为细胞炎性坏死，是一种程序性死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，其过程主要依靠炎性小体激活caspase家族的部分蛋白。有研究显示，FABP4可激活炎性小体NLRP3，而NLRP3与心血管疾病的发生密切相关[7]。目前关于细胞焦亡对心血管疾病影响的研究主要集中于动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤方面，而对其他疾病如心律失常、心力衰竭、心肌炎等的研究较少，其发病机制尚不完全明确。此外，抑制FABP4可预防心血管疾病的发展[8]，但FABP4调节心血管疾病的病理生理机制仍不明确。因此，本研究观察了FABP4在Hcy诱导的大鼠心肌细胞焦亡中的作用，旨在为探讨Hcy引起心肌细胞损伤的机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 恒温CO2培养箱购自德国Heraeus公司，Hcy(优级纯，货号：STBJ0903)购自德国Sigma公司，微量台式离心机(5415D型)购自德国Eppendorf公司，细胞全蛋白提取试剂盒(货号：P0013F)购自上海贝博生物技术有限公司，FABP4引物购自广州锐博生物科技有限公司，反转录试剂盒(货号：AJ90851A)、荧光定量PCR试剂盒(货号：AJE1566A)购自宝日医生物技术(北京)有限公司，FABP4(12802-1-AP)购自美国Proteintech公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，NLRP3(#10151)购自美国Cell Signaling Technology公司，caspase-1(AF5418)、IL-1β(AF5103)购自美国Affinity公司，BMS-309403(HY-101903)抑制剂购自美国MCE公司，内参抗体β-actin(AC028)购自武汉ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 复苏心肌细胞(H9C2)，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，次日用含10%胎牛血清的DMEM培养基换液，当细胞密度增长到70%～80%时按实验目的将细胞进行分组，继续置于37 ℃、5% CO2环境中培养。

1.2.2 Western blotting检测FABP4和焦亡相关蛋白的表达 将细胞分为对照组(0 mmol/L Hcy)和Hcy组(3 mmol/L Hcy)[9]，分别处理24 h。采用总蛋白提取试剂盒提取心肌细胞总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，上样30 μg，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，100V 1.5 h后将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃孵育兔抗鼠FABP4(1:1000)、兔抗鼠NLRP3抗体(1:500)、兔抗鼠caspase-1抗体(1:500)、兔抗鼠IL-1β抗体(1:500)过夜，第2天洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1:5000)，室温孵育2 h，洗膜3次，加ECL混合溶液，曝光、显影，以β-actin作为内参，保存FABP4、NLRP3、caspase-1与IL-1β实验结果用于后续统计。

1.2.3 qRT-PCR检测心肌细胞中FABP4 mRNA的表达 细胞分组同1.2.2，根据RNA提取试剂盒提取心肌细胞总RNA，反转录为cDNA，条件为：37 ℃ 15 min、37 ℃ 5 s，4 ℃保存。通过荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40个循环。正向引物序列：3＇-TGTGCAGAAGTGGGATGGAAAGTC-5＇；反向引物序列：3＇-GCAGCATAACTCACCACCACCAG-5＇。反应结束后根据扩增曲线按照公式2-ΔΔCt计算FABP4的含量[ΔΔCt=(Ct待测样品-CtGAPDH待测样品)-(Ct校正样品-CtGAPDH校正样品)]。

1.2.4 激光共聚焦观察焦亡相关蛋白的表达 为进一步证实Hcy使心肌细胞中焦亡相关蛋白表达升高，对心肌细胞中NLRP3、caspase-1进行双染，对IL-1β进行单染，观察心肌细胞中NLRP3、caspase-1的蛋白表达和共定位及IL-1β的表达情况，其中双染时绿色代表NLRP3，红色代表caspase-1，蓝色代表细胞核，单染时红色代表IL-1β，蓝色代表细胞核。将心肌细胞接种于激光共聚焦小皿，待细胞密度达80%后，用3 mmol/L Hcy处理心肌细胞，将细胞分为对照组(0 mmol/L Hcy)和Hcy组(3 mmol/L Hcy)，24 h后弃去培养基，冷PBS清洗心肌细胞5 min；4%多聚甲醛固定30 min，10% H2O2作用10 min，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清封闭1 h，4 ℃摇床过夜孵育一抗，第2天回收一抗，PBS 洗3次，每次5 min；室温孵育二抗2 h，DAPI染色5 min，PBS洗3次；抗荧光淬灭剂封片，采集图像并保存。

1.2.5 加入FABP4抑制剂(BMS-309403)后焦亡相关蛋白的表达情况 将细胞分为三组：对照组(0 mmol/L Hcy)、Hcy组(3 mmol/L Hcy)及Hcy+BMS-309403组(3 mmol/L Hcy和50 μmol/L BMS-309403)。培养心肌细胞至对数生长期，待细胞融合达60%～80%时，用2.1 ml DMSO溶解BMS-309403制备成5 mmol/L储备液，分装保存。在50 ml离心管中将0.25 ml储备液加入25 ml配好的Hcy培养基，混匀，加入4 ml含抑制剂的培养液培养细胞，24 h后取出用于实验。Western blotting检测FABP4和焦亡相关蛋白的表达，步骤同1.2.2。

1.3 统计学处理 采用Prism 7.0软件进行统计分析。测量结果均为计量资料，以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌细胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表达情况 Western blotting检测结果显示，与对照组比较，Hcy组NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表达水平明显升高(P＜0.05，图1)。

图1 Western blotting法检测大鼠心肌细胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表达(n=3)Fig.1 Protein expression of NLRP3 (A), caspase-1 (B) and IL-1β (C) in cardiomyocytes of rats (Western blotting, n=3)

2.2 心肌细胞中FABP4 mRNA和蛋白的表达情况分别采用qRT-PCR及Western blotting检测心肌细胞中FABP4 mRNA和蛋白的表达，结果显示，与对照组相比，Hcy组FABP4 mRNA和蛋白的表达水平均明显升高(P＜0.05，图2)。

图2 两组大鼠心肌细胞中FABP4蛋白(A)及mRNA(B)的表达情况(n=3)Fig.2 Expression of FABP4 protein (A) and mRNA (B) in cardiomyocytes of rats detected with Western blotting and qRT-PCR respectively (n=3)

2.3 大鼠心肌细胞中焦亡相关蛋白的表达 免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，Hcy组心肌细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达水平均明显升高(图3)。

图3 免疫荧光检测大鼠心肌细胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的表达情况(激光共聚焦显微镜，n=3)Fig.3 Immunofluorescence detection of the expression of NLRP3, caspase-1 and IL-1β in myocardial cells of rats (Laser scanning confocal microscope, n=3)

2.4 抑制FABP4后心肌细胞焦亡相关蛋白的表达情况 Western blotting检测结果显示，与对照组相比，Hcy组及Hcy+BMS-309403组FABP4、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表达明显增加(P＜0.01或P＜0.05)；与Hc y组比较，Hc y+BMS-309403组FABP4、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表达明显下降(P＜0.05或P＜0.01)(图4)。

图4 BMS-309403对大鼠心肌细胞FABP4(A)、NLRP3(B)、caspase-1(C)和IL-1β(D)蛋白表达的影响(Western blotting, n=3)Fig.4 Effect of inhibitor (BMS-309403) on the protein expression of FABP4 (A), NLRP 3(B), caspase-1 (C) and IL-1β (D) in cardiomyocytes of rats (Western blotting, n=3)

3 讨 论

Hcy是维持生命活动所必需的生物硫醇，在细胞内具有氧化应激和维持细胞稳态的作用[10]。Hcy为半胱氨酸的同系物，是一种非蛋白质氨基酸，可作为多种疾病如心血管疾病、骨质疏松症、血栓形成和神经精神疾病等的标志物[1]。既往研究表明，Hcy可通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途径对内皮细胞造成不可逆的损伤。也有研究表明，与无心力衰竭患者相比，慢性心力衰竭患者血中Hcy水平明显升高，且随患者病情加重而剧烈增加，可作为慢性心力衰竭诊断及心功能评价的依据[11]。Hcy水平升高不仅可诱导血管内皮细胞及平滑肌细胞损伤，也可直接损伤心肌细胞，但其具体机制仍不明确，因此，本研究探讨了Hcy对心肌细胞焦亡的影响。

焦亡是一种通过caspase-1介导、以细胞质膜破坏及细胞成分和促炎性介质释放至胞外为特征的细胞程序性死亡[12]。细胞焦亡由细胞损伤反应诱导，是依赖caspase-1活性的炎性程序性死亡。当caspase-1蛋白酶活化时，切割并激活特定的细胞靶点，包括消皮素D、促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18。消皮素D的N端片段形成质膜小孔，引起细胞质的渗漏和细胞的破裂，释放IL-1β和IL-18，使炎症加剧。焦亡引起的过度炎症反应可加重细胞损伤，除细胞凋亡、坏死和自噬之外，其在心肌缺血再灌注损伤中也起着至关重要的作用[13-14]。有研究发现，在心肌梗死模型中心脏组织中caspase-1酶活性增加、梗死区域心肌细胞内炎性小体组成成分含量升高，提示利用体外模型的炎性小体经典激活方法可使心肌细胞caspase-1活化，从而诱导细胞焦亡的发生[15]。本研究发现Hcy处理后心肌细胞焦亡相关蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β)表达明显升高，提示Hcy可明显促进心肌细胞焦亡的发生。

目前已在不同组织中发现了12种FABP，分别为脂肪细胞型(adipocyte-FABP，A-FABP)、心肌型(heart-FABP，H-FABP)、肝型(liver-FABP，L-FABP)等[16]。FABP4是冠心病稳定患者冠状动脉介入治疗后复合心血管事件的独立预测因子之一[17]。FABP4是脂质代谢的中枢调节剂，它作为一种将脂质代谢与炎症联系起来的递质而发挥作用。据报道，心包脂肪组织、脂肪细胞中的FABPs水平明显升高，且与肥胖人群的心脏功能障碍相关[16]。有研究发现，FABP4可通过调节环氧合酶2(COX2)和白三烯A4(LTA4)的活性来调节二十烷类化合物的平衡，最终影响巨噬细胞的功能[18]。也有研究发现，抑制FABP4可减少脂多糖诱导的NLRP3炎性小体激活及IL-17A产生[19]。沉默FABP4可使脂多糖诱导的caspase-3和caspase-9活性明显降低，并减少促炎细胞因子的释放[20]。本研究结果显示，Hcy干预后，心肌细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1及IL-1β表达水平明显升高，FABP4表达水平也明显升高。NLRP3是一种新的蛋白复合体，能适应大量的内源性和外源性危险信号，诱导瞬时产生IL-18和IL-1β。NLRP3作为代谢紊乱的传感器，可被FABP4激活，从而促进caspase-1、IL-1β的分泌[7]。本研究还发现，使用FABP4抑制剂BMS-309403后，心肌细胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表达水平明显降低，提示FABP4表达降低可能会减少心肌细胞的焦亡，从而发挥心肌保护作用。

综上所述，本研究结果显示，抑制FABP4对心肌细胞具有保护作用。心肌细胞焦亡参与了多种心血管疾病的进程，为干预心血管疾病寻找可能的靶点提供了新思路。未来应进一步探讨抑制FABP4减轻心肌细胞焦亡的具体机制。