猪圆环病毒2d 型灭活苗临床免疫效果评价

肖 敏 ，刘 建 ，卢 昌 ，曹华斌 ，王 闯 *

（1.江西正邦养殖有限公司，江西 南昌 330096；2.江西正邦农业科学院，江西 南昌 330096；3.江西农业大学，江西 南昌 330045）

猪圆环病毒2 型（Porcine circovirus type-2，PCV2）是仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原体。PCV2 在各个国家和地区都普遍存在，且各个阶段的猪群均表现出极强的易感性。PCV2 感染后主要是侵害猪的免疫系统，使机体处于免疫抑制状态，从而继发感染其他病原微生物，严重影响养猪业的经济发展。PCV2 的危害性并不只是针对于该病毒，而是因主要表现在它与猪副嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、猪蓝耳病病毒以及猪细小病毒等的继发感染。

根据PCV2 基因序列的差异，可将其分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d 和PCV2e 五个亚型。Wei 等在2011-2012 对华南大区分离的66 株PCV2 进行基因分析，结果显示其中45 株为PCV2d型，占比68.2%。2013-2015 年，Zhan 等对中国南部地区的62 株PCV2 分离株进行基因比对，结果发现PCV2d 型高达72.6%。Qu 等在2012-2016 年在湖南地区的流行病学调查中发现，在PCV2 阳性样本中PCV2d 的感染率为67%。这些表明，在我国PCV2d 已日渐成为主要的流行毒株。GUO 等用PCV2a、PCV2b 和PCV2d 三个毒株分别给30 日龄健康仔猪进行攻毒，结果发现PCV2d 攻毒组在病变脏器中的核酸拷贝数高于PCV2a 和PCV2b 组，表明PCV2d 的毒力强于PCV2a 和PCV2b，目前，我国大部分猪场都是PCV2 阳性场，并且很难净化，也没有可以治疗的特效药。因此，对于圆环病毒的防控主要还是依靠疫苗免疫。灭活苗的稳定性好，安全性高，目前市场上应用最广的还是圆环病毒灭活苗。

本研究采用PCV2 的2d 型毒株制备了PCV2 灭活苗，通过免疫35 日龄仔猪，利用血清抗体和抗原阳性率等指标评价其免疫效果。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞

病毒为江西正邦农业科学院动物保健研究所从湖北黄冈某猪场的阳性病料中分离，经测序分析为PCV2d 型，命名为HB/ZB 株，经测 定TCID50为107.0/mL；PK15 细胞，购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。

1.2 主要试剂与试验动物

ISA206 佐剂，购自法国赛比克；DNA 提取试剂盒，购自金瑞鸿捷生物科技有限公司；猪圆环病毒2 型ELISA 抗体检测试剂盒（批号：B20181214），购自韩国金诺；商品苗A、B（均为2b 型毒株灭活苗）为国药动保和贵州福斯特公司生产。120 头21 日龄健康仔猪，集团规模化养殖场自养。

1.3 灭活疫苗的制备与检验

按 1∶2 000 比例向病毒液中缓慢加入β-丙内酯，边加边搅拌，然后在4℃条件下搅拌灭活48 h，再置于37℃水浴2 h。取灭活病毒液与PK15 克隆细胞悬液（细胞浓度为2×105个/mL）按1∶9 混合，接种于25 cm2的细胞培养瓶。同时设置病毒阳性对照，盲传3 代，采用间接免疫荧光法进行灭活检验。

将检验合格的灭活病毒液置于乳化容器中，按水相与油佐剂3∶1 的比例缓慢加入ISA206 佐剂，边加边搅拌，然后以800 r/min 搅 拌30 min，制 成水包油型疫苗。对成品苗进行无菌和物理性状的检验，按照现行的《中国兽药典》附录进行无菌检验。

1.4 对仔猪的免疫效果评价

将120 头21 日龄仔猪，随机分成4组，每组30头。分别为试验组，商品苗A 组，商品苗B 组，对照组。试验组每头仔猪颈部肌肉注射2 mL对应疫苗，对照组注射2 mL 生理盐水。分别于免疫后7 d、14 d、21 d、35 d、105 d 采集血清。免疫后35 d、105 d 称体重，记录死亡数，统计成活率。

免疫后21 d、105 d 血清中核酸数量的检测采用实时荧光定量PCR（qPCR）法。根据Genbank 中已知的PCV2 基因序列设计引物，引物序列为F：CCAGGAGGGCGTTCTGACT，R：CGTTACCGCTGGAGAAGGAA，引物由华大基因合成。扩增体系 为20 µL：TB Green Premix DimerEraser（2X）10 µL，ROX Reference Dye（50X）0.4 µL，上、下游引物各（10 µmol/L）0.6 µL，模板2 µL，灭菌水6.4 µL。标准品为本实验室制备并经过验证。反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 34 s，40 个循环。

血清中抗体水平的检测采用间接ELISA 法，严格按照试剂盒步骤进行检测。

1.5 统计与分析

本试验数据采用SPSS 22.0 软件，对各组间数据通过单因素方差分析（One-Way ANOVA），抗原与抗体阳性率比较采用卡方检验。

2 结果与分析

2.1 疫苗的检验

在荧光显微镜下未观察到荧光，表明灭活彻底。外观检验为乳白色，稳定性试验：800×g 离心15 min 未出现破乳现象。无菌检验时无菌落形成，无菌检验合格。

2.2 对仔猪的免疫效果评价

2.2.1 疫苗对体重及成活率的影响

免疫105 d 后试验组存活率为93%，商品苗A 组和商品苗B 组的存活率分别为95%、93%，未免疫对照组的存活率为70%。试验组与商品苗组的存活率都高于对照组。由表1 可以看出，免疫前各组体重无显著性差异（P＞0.05），免疫35 d、105 d 后试验组与商品苗的2 个组的增重均显著高于对照组（P＜0.05）。

表1 免疫35 d、105 d 后各组体重 kg/头

2.2.2 疫苗对仔猪血液病毒载量的影响

免疫后21 d 各组血清抗原检测均为阴性。由表2 可以看出，免疫后105 d 试验组与2 个商品苗组抗原含量与抗原阳性率显著低于阴性的对照组（P＜0.05），且试验组的抗原阳性率又显著低于两个商品苗组（P＜0.05）。

表2 免疫105 d 后各组抗原含量和抗原阳性率

2.2.3 疫苗对仔猪抗体水平的影响

免疫前后不同日龄各组血清抗体水平见图1，免疫前后各组血清抗体阳性率见表3。从图1 和表3 可以看出，免疫前各组抗体水平较高，且抗体阳性率100%，表明该猪群母源抗体水平较好。免疫后35 d 各组的抗体水平持续下降并到达最低点，但此时试验组仍能维持较高的阳性率，且抗体水平高于其余3 组。免疫后105 d，各组抗体全部升高，各组间差异不显著（P＞0.05）。

图1 免疫前后不同日龄各组血清抗体水平

表3 免疫前后各组血清抗体阳性率

3 讨论

2014-2015 年翟宝库等对大庆周边的未免疫猪群进行了血清学调查，结果显示猪群PCV2 的感染率为54.7%。时庆贺等对2016-2017 年 对13 份PCV2 阳性样品进行测序分析，其中7 株为2b 型，6 株为2d 型。吴明臻等对浙江金华地区2012-2018 年的PCV2 进行了分子流行病学调查，未发现PCV2c型 和PCV2e 型，PCV2a 和PCV2b均为13.04%，PCV2d 型占73.91%。表明流行毒株在逐渐向2d 型过渡。因此本研究选用本实验室分离的2d型毒株HB/ZB 株来制备灭活苗，对于猪群抵抗PCV2 感染提供更好的保护作用。

本研究中的免疫组的仔猪均增重显著高于对照组，这与庄汝柏、周华林等的研究结果一致。PCV2 感染常导致猪皮炎与肾病综合征、渗出性皮炎、先天性震颤和肠炎、肉芽肿性肠炎、生殖障碍、猪呼吸道疾病综合征，亚临床型感染的特点是生长性能不良。本研究中研制的灭活苗能显著地提高仔猪的均增重，表明该疫苗对有效改善PCV2 的亚临床感染方面有良好的效果。

翟宝库等研究发现，仔猪仅免疫1 针PCV2 疫苗，抗体水平并不能达到理想效果，需在首免后2～4 周再进行1 次加强免疫才能获得更好的保护力。吴忻等选择抗体阴性的14 日龄仔猪进行免疫，在免疫后6 周抗体阳性率才达到100%，仔猪存在较长时间的抗体空档期。这与本研究中仔猪育肥前期抗体阳性率100%，抗原全阴性的结果一致。本研究中在免疫后35 d 对照组与2 个商品苗组虽然抗体水平维持在临界水平以上，但是抗体阳性率都低于80%，表明在育肥后期，这些猪对于PCV2 的感染已经不具备足够的保护力。这个结论在抗原检测上也得到了证实，免疫后105 d 各组抗原阳性率开始急剧升高。因此有必要在6 周龄以前再进行1 次加强免疫。