东部平原矿区复垦对土壤微生物固碳潜力的影响

2022-04-01董文雪朱燕峰于昊辰浮1

煤炭学报 2022年3期

马静，董文雪，朱燕峰，于昊辰，肖栋，陈浮1,

(1.江苏省煤基温室气体减排与资源化利用重点实验室，江苏徐州 221008；2.中国矿业大学中阿微生物采矿与土壤生态修复联合研究中心，江苏徐州 221116；3.中国矿业大学化工学院，江苏徐州 221116；4.中国矿业大学环境与测绘学院，江苏徐州 221116)

东部平原矿区具有潜水位高、煤粮复合度高等特点，采煤活动对地表扰动强烈，导致上覆农田塌陷、积水和盐碱化，土体结构破坏、水体污染和生物量锐减十分普遍。高潜水位导致沉陷地表易积水，从而改变水土平衡和碳氮循环，降低了农田质量和生产力。当前复垦是沉陷区生态修复和恢复农业生产的重要手段，主要包含充填复垦或挖深垫浅等不同模式。但东部平原矿区复垦土壤肥力低、团聚体结构特征差、功能弱，主要原因是受潜水位季节性变化的控制，客土耕作层极易返碱，从而影响微生物群落发育和功能重建。微生物作为土壤中最为活跃的组分，对重构土壤的发育和功能重建具有不可替代的激发催化作用。从分子生态学视角探索复垦土壤固碳菌群的变化及响应机制，识别复垦的环境效应及权衡土-粮食-碳之间关系，对提升土壤固碳潜力，保障粮食安全和维护生态安全，并促进碳中和目标实现等具有重要的意义。

土壤微生物不但影响作物的生长、产量和品质，还对维持土壤生产力、抵抗非生物胁迫和恢复重要功能上起作用。作为分解者，能分泌多种酶降解动植物残体及其他有机物，并加速碳的转化与迁移。一方面，土壤微生物通过参与凋落物分解或直接固定空气中CO，促进碳积累；另一方面，微生物呼吸作用及参与的有机碳矿化过程又会消耗土壤有机碳，并向空气释放CO。微生物种类繁杂，介导了多样化代谢功能。其中：碳固定过程对维持生态系统平衡极其重要。目前已发现微生物固碳途径有6条：卡尔文循环、还原柠檬酸循环、还原乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸双循环、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环、二羧酸/4-羟基丁酸循环。土壤固碳能力受多重因素影响，扰动状况、理化性能、根系分泌物、植被种类和多样性等影响着碳源的分配，从而影响参与此过程特定菌群的结构和功能。高通量测序、DNA分子指纹图谱、Geochip和qPCR芯片等分子生物学方法和同位素示踪技术发展促成了微生物群落研究不断深入，并逐渐成为碳循环研究的高效工具。目前固碳菌及固碳基因研究集中于水田，发现微生物固碳能力与酶活性有关，高酶活性代表土壤自养微生物固碳潜力更高。同时微生物参与了碳固定、甲烷代谢、碳降解等多个重要碳循环过程。东部平原矿区自然条件相对好，充分挖掘固碳微生物功能不仅有助于提升土壤肥力、保障粮食生产能力，还可以增加生态碳汇、减缓全球气候变化的压力。

目前，矿区复垦土壤涉及碳相关的研究主要集中于土壤理化及碳组分变化。如USSIRI等考察复垦后土地利用方式对矿区土壤性质和碳储存影响时发现，复垦土壤pH值和电导率较高，土壤团聚体对有机碳累积起至关重要的作用。GANJEGUNTE等研究植被、土壤质地和木质素含量对矿区复垦土壤总有机碳积累的影响，发现木质素含量显著影响有机碳的累积。WICK等利用稳定性同位素检测复垦土壤团聚体和有机质的动态变化，发现随复垦时间延长，土壤大团聚体比例增加，微团聚体比例下降。DAS等对比复垦后和未复垦土壤无机碳、微生物量碳和煤组分碳的含量，发现复垦后土壤无机碳和微生物量碳占比更高。DANGI等发现复垦后5～14 a为微生物群落恢复的最重要阶段，但半干旱矿区土壤微生物需要更长的时间才能恢复到原水平。余健等研究发现高潜水位复垦土壤中全碳和有机碳含量均小于正常耕地。李奇超等研究发现高潜水位复垦土壤有机碳含量随着复垦年限增加而不断增加，且表层恢复率快于深层土壤。其外，有研究已经认识到微生物的重要催化作用，并将丛枝菌根应用于矿山生态修复。然而，大多责任矿山不愿意投入而一般科研机构又无力长期投入资金，导致很难长时序监测复垦土壤质量变化，有关矿区固碳微生物及固碳基因的研究极少，无法弥补复垦土壤演化及调控知识缺失的鸿沟。

当前东部矿区面临生态修复、粮食安全和固碳增汇等多重压力，从分子生态学视角研究微生物介导的土壤碳固定过程及响应机制，既可改善土壤肥力、保障粮食安全，又提升生态系统服务、固碳增汇。为此，笔者选择山东邹城东滩矿3个复垦年限和1个对照为对象，利用高通量测序和Geochip分析，揭示东部矿区复垦土壤固碳菌群随复垦时间的演化，探索占主导地位的固碳菌群及与其环境因子间相互作用和机制，为科学评估复垦土壤质量演变和固碳增汇能力提供新见解。

1 材料与方法

1.1 研究区

研究区位于山东邹城东滩矿复垦区(35.14°N～35.55°N，116.78°E～117.48°E；2000大地坐标系)。该区属于暖温带季风气候，年均降雨量为777.1 mm，年均气温为14.1 ℃。土壤类型为棕色潮土，含砂粒22.3%(>0.02 mm)、粉土65.9%(0.020～0.002 mm)和黏粒11.8%(<0.002 mm)。土壤密度为1.48 g/cm。2002年、2005年和2011年，采用煤矸石充填、表土回填，再机械压实分3次治理塌陷区，一般充填200～400 cm，表土回填深度为80 cm。依据不同的复垦时长，分别记为R17(复垦17 a)、R14(复垦14 a)和R8(复垦8 a)，复垦后由农业开发公司承包统一种植，小麦和大豆轮作，一年两熟，小麦单季施常规复合肥600 kg/hm作底肥，拨节时施氮肥150 kg/hm，机械化收割时留茬高20～25 cm。大豆单季施量常规复合肥450 kg/hm作底肥，机械化收割时自动粉碎还田。笔者选择的样地除复垦年限不同外，地形、气候、成土母质、耕作和施肥等管理方式完全一致，形成一个完善的复垦时间序列。

1.2 土壤样品采集与前处理

2019-05-04,采用随机采样方法，从每块复垦区各采集15个表层土壤样本(即地面以下0～10 cm)。此外，从复垦区域附近选取3块未受采矿活动破坏的农田采集15个表层土壤样品用作对照(CK)，且其与复垦样地耕作和施肥管理方式一致。土壤取回后，除去植物根系、砾石等杂质，并将土样充分混合均匀后分为2份:一份在室温下风干，均质化后过2 mm筛，用来测定土壤基本理化性质和部分土壤酶活性；另一份未经处理的新鲜土壤子样本，保存于-20 ℃冰箱中，用于后续微生物群落结构和功能基因分析及部分土壤酶活性测定。

1.3 样品测试

土壤pH值(水土质量比5∶1)用数字酸度计(PHC-3C，上海雷磁)测定；有机碳(SOC)采用重铬酸钾-比色法测定；微生物碳(MBC)的测试方法为氯仿熏蒸-浸提法；溶解性有机碳(DOC)采用TOC自动分析法测定(总有机碳分析仪，日本岛津)；易氧化有机碳(EOOC)采用333 mmol/L KMnO氧化法测定。多酚氧化酶(PPO)活性采用邻苯三酚比色法测定，以培养2 h后1 g土壤中紫色没食子素的毫克数表示；β-葡萄糖苷酶(BG)活性采用硝基酚比色法测定，以培养1 h后1 g土壤中的对硝基酚的微克数表示；过氧化氢酶(CAT)活性采用高锰酸钾滴定法测定，以1 g土壤1 h内消耗0.02 mol/L KMnO的体积表示。

1.4 高通量测序和Geochip分析

使用Fast DNA SPIN kit(MP Biomedicals，美国)，并遵循试剂盒说明，从-20 ℃冷藏的60个新鲜土样中提取DNA，使用NanoDrop one测定DNA浓度和纯度。引物515F(5′-GTGCCAGCCGGTAA-3′)和907R(CCGTCAATTCMTTRAGTT)用来扩增细菌16S rRNA基因的V4-V5区域。PCR反应使用BioRad S1000仪器(伯乐，美国)进行。50 μL的PCR混合物含有25 μL Taq复合物、每个引物1 μL(10 M)和3 μL DNA模板(20 ng/μL)。PCR扩增程序如下：① 94 ℃ 5 min初始化；② 30个循环，94 ℃ 30 s变性，52 ℃ 30 s退火， 72 ℃ 30 s延伸；③ 72 ℃ 10 min最终延伸。利用 GeneTools Analysis Software(Version4.03.05.0，SynGene)对PCR产物进行浓度对比后，按照等质量原则计算各样品所需体积，将各PCR产物进行混合。使用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒回收PCR混合产物，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段。按照NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina标准流程进行建库操作。使用Illumina Hiseq2500 平台对构建的扩增子文库进行PE250测序(美格基因，广州)。

测序数据采用Trimmomatic软件(V0.33，http://www.usadellab.org/)分别对双端的Raw Reads数据进行质量过滤，再利用FLASH(V1.2.11，https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)软件对每对PE reads进行拼接，将成对的reads拼成1条序列。根据每条序列首尾两端的barcode和引物信息等，利用Mothur软件(V1.35.1，http://www.mothur.org)将序列分配至对应样品，最终取得有效的拼接片段。利用usearch软件(V10，http://www.drive5.com/usearch/)对所有的拼接片段进行聚类，默认以97%一致性将序列聚类成为操作分类单元(OTU，Operational Taxonomic Units)。并用usearch剔除嵌合体和singleton序列，然后注释代表性序列(Silva，https://www.arb-silva.de/)。

Geochip分析需要先提取土壤微生物总DNA/RNA，并按要求检测总量及纯度等，合格核酸样品进行荧光标记、杂交、检测(美格基因，广州)。使用ImaGene 6.0软件(http://www.image-net.org/)转换探针信号，按质控要求提取raw_data，并对raw_data进行标准化取得normalized_data，再将normalized_data中每个基因对应的所有信号强度汇总为基因信号强度norm_gene_intensity。固碳基因信号强度代表固碳基因相对丰度，一定程度上反映了物种的固碳潜力。最后，按raw_data分别统计功能大类(Gene_category)、功能亚类(Sub_category)和基因(Gene)3个类别探针检出数及信号强度，绘制功能基因柱形图。16S rRNA原始序列数据已上传NCBI数据库，登记号为PRJNA674491。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 20.0 软件(IBM，美国)对土壤理化、酶活性、丰度进行单因素方差(ANOVA)和T-检验，利用Origin 9.0软件(Origin Lab，美国)绘制土壤固碳菌群功能基因丰度图，小提琴图和相关性热图在Hiplot平台(https://hiplot.com.cn/)上传数据后运算获得。利用Amos7.0软件拟合结构方程模型(SEM，Structural Equation Model)分析土壤理化、酶活性、固碳基因信号强度及相关固碳菌门丰度等变量之间关系。分子生态网络分析参照文献[26]。

2 结果与分析

2.1 不同复垦年限下土壤部分理化性状和酶活性变化特征

图1中，土壤有机碳质量分数随复垦年限呈上升趋势，R17中SOC已高于CK，但与CK无显著差异。复垦土壤溶解性有机碳质量分数均高于CK，并与CK呈极显著性差异(<0.001)。土壤微生物量碳质量分数随复垦年限持续增长且呈极显著性差异(<0.001)，R8中MBC质量分数仅为CK一半，但R17已远高于CK(<0.001)。土壤易氧化性有机碳含量随复垦年限升高，略高于CK，但不同处理组间无显著差异。复垦土壤pH呈弱碱性，与CK呈极显著性差异(<0.001)，pH随复垦年限先升后降，但不同复垦年限差异不显著。土壤β-葡萄糖苷酶活性随复垦年限不断提高，均高于CK。R17中BG活性最高，且与CK呈显著性差异(<0.01)。复垦土壤过氧化氢酶活性均高于CK，且与CK呈显著性差异(<0.001)。复垦年限对土壤多酚氧化酶活性影响显著，R17 PPO活性极显著高于CK(<0.001)。

2.2 不同复垦年限下土壤固碳功能基因和相关微生物群落结构特征

卡尔文循环涉及的FBP_aldolase，FBPase，GAPDH_Calvin，PRI，TIM，pgk，tktA，rubisco和PRK等固碳基因信号强度随复垦年限增加略有上升(图2(a))，R17除FBPase信号强度稍高于CK外，其他信号强度与CK相近，无显著差异。厌氧乙酰辅酶 A途径涉及的fthfs固碳基因信号强度R17已高于CK，但并无显著性差异。细菌小体涉及的CsoS1_CcmK和ccmL固碳基因信号强度也随复垦年限增加略有上升，R17年与CK持平，无显著性差异。相关性热图分析显示：R8和R14所有固碳基因信号强度显著弱于CK和R17(图2(b))。R17和CK的固碳基因信号强度十分接近，表明微生物固碳潜力随着复垦时间增加而增加。

土壤SOC主要源于微生物固碳及其残体，土壤固碳基因信号强度越大，表明菌群在单位质量土壤中丰度越高，固碳潜力也越大。依据Geochip分析结果推测：固碳菌主要分布于4种富集菌门和2种稀有菌门中。富集菌门包括酸杆菌门()、放线菌门()、拟杆菌门(Bacteroidetes)、和变形菌门(Proteobacteria)。稀有菌门包括蓝细菌()和厚壁菌门()。其中：CsoS1_CcmK和ccmL基因多分布于蓝细菌()、厚壁菌门()和变形菌门()，FBP_aldolase,FBPase,GAPDH_Calvin,PRI,TIM,pgk,tktA,rubisco和PRK多集中于蓝细菌()和变形菌门()，fthfs则主要分布于拟杆菌门()、厚壁菌门()和变形菌门()，少数分布于酸杆菌门()和放线菌门()。

注：*在0.05水平(双侧)上显著性相关；**在0.01水平(双侧)上显著性相关；***在0.001水平(双侧)上显著性相关；ns代表无相关性图1 不同复垦年限下土壤理化和酶活性的变化Fig.1 Change in soil properties and soil enzyme activities with different reclamation ages

图3中，高通量测序结果表明：复垦土壤中酸杆菌门()丰度均高于CK，且呈极显著性差异(<0.001)，但不同复垦年限无显著差异。放线菌门()丰度随复垦年限增加呈先上升再下降的趋势，始终高于CK，但无显著性差异。拟杆菌门()丰度变化趋势与放线菌门相似，但始终低于CK，且呈显著性差异(<0.01)。蓝细菌()、厚壁菌门()和变形菌门()丰度随复垦年限呈不同的变化趋势，但丰度始终显著低于CK(<0.01)。尽管固碳基因所属菌门丰度差异大，但固碳基因信号强度并无显著差异，表明物种和功能基因丰度并不存在直接正向关系。

注：不同字母表示显著差异 (P<0.05)图2 不同复垦年限下土壤固碳功能基因特征变化Fig.2 Variation of soil carbon-fixing functional genes with different reclamation ages

注：*在0.05水平(双侧)上显著性相关；**在0.01水平(双侧)上显著性相关；***在0.001水平(双侧)上显著性相关；ns代表无相关性图3 不同复垦年限下土壤固碳相关微生物丰度变化Fig.3 Variation of soil carbon-fixing related microbial ahundances with different reclamation ages

2.3 土壤固碳基因与理化、酶活性的相关关系

土壤固碳基因与理化、酶活性的相关性分析表明：R8(图4(a))中变形菌门()与DOC呈显著负相关(<0.05)，但与BG酶活性呈显著正相关(<0.05)。R14(图4(b))中放线菌门()和厚壁菌门()与BG酶活性显著负相关(<0.05)，拟杆菌门()和蓝细菌门()与PPO酶活性呈显著性正相关(<0.01)。

注：*在0.05水平(双侧)上显著性相关；**在0.01水平(双侧)上显著性相关；***在0.001水平(双侧)上显著性相关图4 土壤固碳基因、菌门与理化、酶活性相关性热图。Fig.4 Correlations between carbon-fixing microbial gene and phyla and soil characteristics with different reclamation ages

R17(图4(c))中放线菌门()与PPO酶活性显著正相关，而拟杆菌门()与MBC酶活性显著正相关(<0.05)。CK(图4(d))中厚壁菌门()与PPO酶活性呈显著负相关(<0.001)，并与酸杆菌门()相似，与pH呈显著负相关(<0.05)；放线菌门()则与EOOC酶活性呈显著负相关(<0.05)。上述结果表明：不同处理固碳基因与理化、酶活性的相关性区别较大。复垦土壤BG和PPO酶活性作用大，DOC，MBC和一些固碳基因也有相关性。但CK土壤PPO，EOOC酶活性和pH与一些固碳基因关系紧密。

2.4 不同环境因子对土壤固碳能力的贡献

图4刻画了不同环境因子与土壤固碳基因和菌门之间关系，但无法估算对土壤固碳能力的贡献，为此引入结构方程模型进行拟合分析，R8,R14和CK通过检验，取得3个模型结构且具有一定的差异性。图5(a)显示：R8中pH直接改变了PPO酶活性，从而引起变形菌门()丰度变化，并呈显著负相关。固碳基因PRK和变形菌门()分别负向作用于土壤DOC含量，土壤BG酶活性直接极显著正向作用于变形菌门()，放线菌门()直接极显著正向作用于固碳基因tktA，而厚壁菌门()直接极显著负向作用于固碳基因pgk。

图5(b)显示,R14土壤MBC含量直接正向作用于PPO酶活性，同时负向作用于固碳基因FBP_aldolase。土壤BG酶活性直接负向作用于固碳基因pgk和FBP_aldolase，CAT酶活显著正向作用于固碳基因FBPase，而放线菌门()则直接反向作用于固碳基因PRK；R17中放线菌门()与PPO酶活性呈正相关关系，FBP_aldolase与变形菌门()呈正相关关系，并与SOC，pH值呈负相关关系，但并未构成结构关系。

图5(c)则显示一个完整的3层递进关系，pH直接负向作用于PRI，并正向影响CAT酶活性再间接负向作用于PRI。此外，pH还直接正向作用于tktA。土壤EOOC直接负向作用于放线菌门()，并进一步间接正向作用于FBPase和PRK，EOOC还直接负向作用于固碳基因pgk和正向作用于土壤PPO酶活性。可以认为，复垦改变矿区土壤pH，操控，调控土壤理化和酶活性，从而影响微生物区系发育，并最终介导土壤碳循环和固碳能力。

为了进一步研究环境因子，固碳基因和固碳菌门之间的互作关系，选取4种富集和2种稀有菌门的相对丰度前10的OTU与土壤环境因子进行网络互作。就网络互作关系而言，3个复垦网络与对照网络相比，富集菌门(红色)未出现显著变化，且具有较多连接度较高的OTUs(图6)。稀有菌门呈现显著性变化(<0.05)，尤其R14样地，稀有菌门OTUs连接度较低，且较少。黄色代表的固碳基因在复垦样地的互作网络中连接度高于对照网络。环境因子(荧光蓝色)在R17网络中的连接度较高，且R17网络结构更接近于对照样地网络，这些结果可能说明长时间复垦活动增强了固碳稀有菌门、固碳基因和环境因子之间的互作关系。就环境适应性而言，固碳菌群中，多数富集菌种与部分稀有菌种可视为土壤微生物群落优势菌种，或可助力东部平原矿区生态恢复。

注：红色代表负相关，蓝色代表正相关。*在0.05水平(双侧) 上显著性相关；**在0.01水平(双侧)上显著性相关； ***在0.001水平(双侧)上显著性相关。箭头上的数值代表标准通径系数，箭头粗细代表相关性高低。红色箭头表示显著负相关(P<0.05)，蓝色箭头表示显著正相关(P<0.05)，虚线箭头表示无显著影响。R2表示通径解释度；χ2为卡方检验中的检验统计量；df表示自由度；P表示相关水平；IGF表示拟合优度指数；RMSEA表示近似误差均方根。图5 土壤理化酶活与土壤固碳菌门和基因的相关结构Fig.5 Structural equation model between carbon-fixing microbial gene and phyla and soil characteristics with different reclamation ages

图6 富集和稀有菌门相对丰度前60 土壤环境因子分子生态网络Fig.6 Molecular ecological networks of the TOP 60 OTUs of abundant and rare bacterial phyla，and soil physicochemical properties

3 讨论

土壤固碳能力依赖于固碳菌群、作物生物量和还田率。随着复垦年限越长，作物量根系和凋落物进入土壤越多，有机肥或化肥输入也越多，外源碳源逐年增加。与此同时，微生物残体、作物凋落物、根系及分泌物等分解转化后形成腐殖质，促进土壤团聚体形成和土壤生物地球化学过程，亦可能促进固碳功能，引发更高的碳固持效应，进而有利于碳积累。本文中，经过长期合理耕作，复垦土壤样地R17中SOC含量已高于CK，MBC含量显著地高于CK，表明复垦土壤碳不断累积，已形成高的碳固持能力。土壤SOC和MBC含量随复垦年限呈上升趋势(图1)，与CHAUDHURI等研究结果一致，说明长时间复垦对SOC和MBC积累具有积极作用。复垦土壤DOC含量显著高于CK，随复垦年限呈先降后升趋势。表层土壤DOC受淋洗向下迁移，复垦打乱土壤层次，造成复垦土壤DOC含量显著高于CK。此外，pH值亦影响DOC含量。在弱碱性条件下，DOC中酸性部分易与钙镁离子发生中和反应，导致DOC含量变化。王金满等研究表明，复垦活动可以改善土壤质量，且随复垦时间增加，土壤质量不断接近原生环境。JACINTHE和LAL研究表明，常规耕作方式下复垦土壤碳库恢复需要50 a，甚至更久时间。这与本文研究结果迥然不同，主要归结于前者的自然条件差、气候干燥，常规耕作为大田机械化+化肥+种植玉米。本研究区自然本底好、雨水较多，且农业投入大，田间管理好，所以不足20 a土壤SOC恢复正常平衡。

土壤中碳与养分元素含量与可利用性影响土壤微生物丰度与活性，而土壤微生物又通过调整自身群落结构和胞外酶分泌，反馈调控土壤元素循环过程。微生物自身可通过分泌胞外酶将土壤中复杂化合物降解为水溶性小分子，供自身和作物生长代谢。图1中长时间复垦改变土壤中可溶性有机碳含量，导致微生物群落结构改变(图3)，进而改变部分土壤酶活性(图1)。BG可将难利用的复杂多糖降解为单糖，成为植物和微生物营养最重要来源。图1中显示BG酶活性随复垦年限持续增加，说明复垦和持续耕作不断改善土壤微生物环境，提升微生物生物量，而此时土壤中的可利用碳源已无法满足微生物生长需求，其自身只能分泌更多胞外酶，催化降解底物为养分和能量，从而促进土壤碳氮循环。PPO是腐殖质化的重要媒介，参与芳香族化合物的转化作用。它与DOC含量相呼应，同步增长，为微生物和植物提供更多的有机营养物质(图1)。复垦土壤CAT显著高于CK(图1)，说明地表塌陷造成农田环境恶化，复垦可增加CAT酶活性，加速分解HO等有害物质，从而促进土壤中物质和能量转化，为农作物生长和微生物生存提供良好的环境。

微生物在几乎所有生态过程中扮演着不可或缺的角色，尤其是养分循环。这些过程主要依赖不同类群的多样化功能，其中固碳能力归结于一类以CO为碳源的自养微生物。它们还可利用SOC作为碳源，分解后产生的CO亦可再次利用。农作物凋落物降解后可为固碳菌提供碳源，可转化为土壤碳库。长时间复垦后，图2,3中固碳基因和相关固碳微生物菌门增加，复垦土壤固碳潜力增加，这在一定程度上表明复垦田块上的长时间农业耕作，亦影响土壤中微生物CO同化功能基因，提升表层微生物的碳同化能力。土壤微生物光合固碳作用往往只发生表层土壤(0～1 cm)中，表层获得同化碳后，可以向地下传输，为下层微生物提供必要的碳源和电子供体，从而激发诱导更多微生物参与碳同化过程。有学者研究得知，不同耕作方式和土地利用可以显著影响稻田土壤中自养微生物的CO同化能力和碳同化关键酶RubisCO酶活性，而RubisCO酶是由固碳基因rubisco表达。土壤固碳功能基因丰度可能是表征土壤微生物固碳能力的敏感性指标。

图4显示复垦土壤中固碳相关菌门仅有酸杆菌门()和放线菌门()丰度大于CK，但复垦土壤固碳基因信号强度却大致相当，尤其是R17与CK无显著性差异，且高于R8年和R11。这表明复垦时间对固碳菌群的组成和功能基因的影响并不相同，主要归结于随复垦年限增加，凋落物和根系及分泌物不断积累，改变了土壤基本性状，从而影响微生物区系发育，再操控了固碳功能基因丰度。先前有研究发现GeoChip分析检测到功能基因信号强度与环境养分含量显著性相关，这与本研究结果完全一致。pH一直被认为是控制细菌组成的关键因子，本研究多数固碳菌类群和固碳基因与pH呈显著负相关，也证实矿区复杂环境下微生物演化仍遵循一般规律。此外，下层充填煤矸石中含有的重金属离子被季节性潜水位变化带到上层土壤，随复垦年限增加，pH下降，重金属活性发生改变亦影响微生物结构与组成。酸杆菌门在矿山土壤酸化生态过程起重要作用，并广泛分布于各种恶劣的自然环境中。复垦样本中酸杆菌门丰度变化与pH值存在相关性，而酸杆菌门相对丰度并没随pH值增加而下降，说明土壤中酸酐菌门变化可能调节了pH变化。与碱性土有较大亲和力的放线菌门丰度增长，同样影响复垦样地pH值变化。而pH是调节细菌群落结构和丰富度的最重要参数，土壤酸碱度改变会影响微生物群落生长。

环境因子通常借助调控微生物结构与功能来间接影响土壤碳库变化，丰富的碳源可满足微生物生长。因此，SOC往往与固碳相关的菌群丰度呈正相关关系，与本研究结果相一致(图4)。复垦土壤中固碳相关菌门丰度与BG,MBC和PPO酶活性呈显著正相关(<0.05)，多数固碳基因与MBC呈负相关关系。但CK中PPO,BG,pH和EOOC与固碳菌群丰度呈显著负相关关系，这反映了固碳菌对土壤环境变化的敏感性。一些研究认为，参与固碳的菌群组成和丰度与土壤类型、环境因子等显著性相关。本研究中富集菌门放线菌门()和变形菌门()，稀有菌门厚壁菌门()等与DOC,MBC,PPO和BG呈显著相关(<0.05)(图5,6)。6种固碳基因亦与DOC,MBC,EOOC直接相关，且部分显著性相关，说明复垦土壤中碳源是影响固碳菌群组成和基因丰度的最主要因子，这与干旱区研究结果完全不同。主要应与东部平原矿区水分充足，其他因子未受限制有关。不同环境因子对微生物群落组成和功能基因丰度的影响十分复杂，可能相互抵消或协同，从而掩盖了环境因子与群落结构之间的真实关系。

分子生态网络分析可揭示土壤微生物菌属间相互作用。图6中网络特征显示微生物组间相互作用以及所涉及物种变化，尤其是富集和稀有菌门的变化。群落的高稳定性是实现其生态功能的重要因素，网络复杂性较高时，易对生物地球化学功能产生正面影响，进而使得微生物群落结构更加稳定。复垦网络中存在一些蜂窝特征，有效地促进不同物种间的沟通并提升对采矿干扰的响应能力。随着复垦时长的增加，网络亦趋于复杂且连接更加紧密，具备更高的干扰耐受性。未来应持续关注农田MBC，PPO及外来碳源输入，操控并调节固碳菌类群和固碳基因丰度，促进复垦土壤固碳潜力，提升矿区生态碳汇功能。