基于网络药理学分析柴胡加龙骨牡蛎汤治疗不寐的作用机制

姚 春，王 萌，孙玉浩，姚 凡，夏 猛，黄良江

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

近年来随着社会节奏的加快，不寐的发病率逐年上升。不寐会严重影响身心健康，导致注意力不集中，甚至引发焦虑、抑郁等一系列症状，加速衰老过程，降低生活质量，因此如何有效治疗该病引起社会的广泛关注［1-2］。

目前临床常用治疗不寐的药物有苯二氮卓类、安定类等，但这些药物常伴有宿醉反应、呼吸抑制以及成瘾性等副作用，因此寻找有效、副作用小的治疗药物是目前亟待解决的难题［3］。柴胡加龙骨牡蛎汤出自《伤寒论》，由柴胡10 g、白芍12 g、白术15 g、茯苓15 g、郁金15 g、丹参15 g、煅龙骨10 g、煅牡蛎10 g、墨旱莲15 g、女贞子15 g等组成，具有培土疏肝、育阴潜阳、镇静安神的功效，是治疗不寐的经验方。临床上我们以此方加减化裁治疗不寐症疗效满意。本研究旨在通过网络药理学技术，从“成分-靶点-通路”多层面分析柴胡加龙骨牡蛎汤治疗不寐的作用机制和作用靶点，为后期进一步开展生物学机制研究及临床应用提供参考。

1 方 法

1.1 柴胡加龙骨牡蛎汤的化学成分搜集 通过以下两个中药数据库对复方成分进行搜集：①中药系统药理学分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），分别检索柴胡加龙骨牡蛎汤中包含的化学成分。以口服生物利用度（OB）、药物相似性（DL）作为筛选标准，搜集OB≥30%、DL≥0.18 的化合物；②BATMAN 数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）检索柴胡加龙骨牡蛎汤的化学成分。去除重复数据后，整合两个数据库中搜集到的化学成分。

1.2 成分靶点的搜集 通过Swiss Target Prediction 平台（http://www.swisstargetprediction.ch/），利用化学成分的“Canonical SMILES”格式，预测有效化学成分对应的作用靶点，整理后剔除重复靶点。

1.3 不寐靶点的搜集 与不寐相关的靶蛋白的收集来自3个途径：①GeneCards（http://www.genecards.org/），这是一个全面的人类基因数据库，涵盖了多个数据库中的基因分析数据。②OMIM（http://www.omim.org/），这是一个不断更新的人类孟德尔遗传疾病数据库，专注于人类遗传变异和表型性状之间的关系。③DiGSeE（http://www.disgenet.org/search），这是一个综合性的基因-疾病关联（GDA）关系数据库，提供了人类疾病的最新内容。在以上数据库中分别以“Sleeplessness”和“Insomnia”为关键词进行检索，去除重复靶点后，共获得2 620个与不寐相关的疾病靶点基因。

1.4 化合物-疾病交集靶点的获取 利用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线分析工具对复方中的化学成分靶点与不寐相关靶点进行分析，以Venny 图的形式表明药物靶点与疾病靶点存在的交集靶点。

1.5 药物-成分-靶点网络的建构 将搜集到的化学成分、不寐的交集靶点导入至Cytoscape（http://www.Cytoscape.org/）软件中，构建“药物-成分-靶点”网络，以探讨柴胡加龙骨牡蛎汤治疗不寐的作用机制。

1.6 蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建 为明确交集靶点之间的相互作用关系，本研究将交集靶点导入STRING（https://string-db.org/）数据库，选取置信度高于0.9 的数据，获取蛋白相互作用的信息文本，将信息文本导入Cytoscape 软件进行可视化及网络拓扑学分析，构建蛋白-蛋白互作网络并筛选核心作用靶点。

1.7 交集靶点对不寐作用靶点的生物功能富集分析 将交集靶点上传至David 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/），进行GO、KEGG 的功能富集分析，并通过Omicshare（https://www.omicshare.com/）云平台对富集分析结果进行分析。

2 结 果

2.1 活性化合物的筛选 通过检索TCMSP 平台，设置检索条件为OB≥30%、DL≥0.18，以及BATMAN 数据库进行联合筛选，共搜集到203个活性成分，去除重复后得到161 个活性成分，我们根据OB 值和DL 值选择排名前30 的草药成分与矿物类成分作为本次研究的主要活性化合物进行分析，见表1。

表1 柴胡加龙骨牡蛎汤的活性化合物信息表

续表1

2.2 中药有效成分与疾病靶点的Venny 分析 通过检索 OMIM、DiGSeE 以及 GeneCard 等 3 个疾病数据库获得与不寐相关的靶点基因，去除重复基因后共获得2 620个相关靶点，与柴胡加龙骨牡蛎汤的302个作用靶点取交集，共得到98 个交集靶点，见图1。98 个交集靶点的详细信息见表2。

表2 98个交集靶点的信息

图1 中药有效成分与疾病靶点的交集

2.3 中药-化合物-靶点网络分析 由129 个节点和652 条边构建的中药-化合物-靶点网络见图2。在该网络中红色节点代表中药，外圈蓝色节点表示靶点，内圈绿色节点表示成分，每条边代表节点与节点之间的靶向作用关系。根据度值（Degree）及中心性值（Betweenness Centrality）进行拓扑学分析，以链接条数多和集中较密集的化合物或靶点在该网络中起主要作用为判断标准，筛选出核心的化合物或者靶点（见表3）。在表中分别列出了DC 值和BC 值排名前5 的成分，从表中可以看到，柴胡加龙骨牡蛎汤具有多成分、多靶点的作用。从化合物来看，Butin（紫铆黄酮）、Eriodictyol（圣草酚）、Oxycurcumenol（莪术烯醇）以及（E）-1，7-Diphenyl-3-hydroxy-1-hepTen-5-one 均可以与13 个靶点蛋白发生相互作用；从中心性值来看，连接度从高到低分为GABRA1［γ 氨基丁酸（GABA）A受体］、ADRA1A（肾上腺素受体α1A）、ESR1（雌激素受体）、ADORA1（腺苷A1 受体）和CYP19A1（细胞色素P450家族19亚家族A成员1）靶点。

图2 中药-化合物-靶点网络图

表3 化合物-靶点网络的关键节点及拓扑学性质

2.4 柴胡加龙骨牡蛎汤靶点PPI 网络的构建与分析 运用String 在线平台对柴胡加龙骨牡蛎汤作用靶点进行PPI 蛋白互作网络分析，将蛋白互作评分置信度设置为0.900，隐藏离散靶点后，将结果以文本形式保存，然后导入Cytoscape 软件中建立靶点PPI 网络（见图3）。该网络涉及98个蛋白和551条连线。根据Degree≥10 的节点制作出前10 的关键蛋白质节点的条形图（见图4），其中关键节点包括TNF、CASP3、HSP90AA1、PPARG、ESR1、APP、HRAS、CCND1、ERBB2、SLC6A4 等，它们在该网络中发挥重要作用，是网络中的核心蛋白。

图3 交集靶点的PPI网络

图4 PPI网络的关键蛋白节点

2.5 GO 富集分析与KEGG 通路富集分析 利用DAVID 数据库对柴胡加龙骨牡蛎汤有效作用靶点进行GO 富集分析，得出结果后按P值由小到大进行排序，选择P＜0.05 的前10 位进行分析（图5）。结果提示柴胡加龙骨牡蛎汤的生物过程（BP）显著富集在对药物的反应（response to drug）、ERK1 和ERK2 级联的正向调节（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）、运动行为（locomotory behavior）等；细胞组成（CC）主要包括质膜的组成部分（integral component of plasma membrane）、质膜（plasma membrane）、神经元细胞体（neuronal cell body）等；分子功能（MF）主要有药物结合（drug binding）、蛋白质同源二聚体活性（protein homodimerization activity）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）等。KEGG 通路富集选取P＜0.01的前20条通路进行分析，并用Omicshare 云平台进行结果可视化分析（图6）。最显著的20 条通路主要涉及：神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羟色胺能突触（Serotonergic synapse）、催乳素信号（Prolactin signaling）、癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、膀胱癌（Bladder cancer）等信号通路。

图5 柴胡加龙骨牡蛎汤对不寐作用靶点的GO分析

图6 柴胡加龙骨牡蛎汤对不寐作用核心靶点的KEGG机制分析

3 讨 论

不寐又称失眠，在临床中以睡眠障碍为常见症状。中医理论认为人与自然整体是一种相互呼应的状态，即“天人合一”。肝主疏泄，调畅人体气机，当肝气不舒、气机枢纽运行不畅时则易阳不入阴，从而引起不寐；同时肝木克脾土，机体的脾胃功能也会受到损害；另外，由于患者长时间不寐，思虑过多，耗伤阴液，使得阴阳互不相藏，累及于肾，虚火上扰，多梦易醒，加重不寐的病情进展。因此，在治疗中以疏肝健脾、育阴潜阳、镇静安神为治则，可收到良好的疗效［4］。

柴胡加龙骨牡蛎汤方中柴胡疏理肝气，解郁祛邪，以复肝用；白芍养阴柔肝，兼可缓急止痛，可防止柴胡疏泄太过；二者共为君药。白术、茯苓辅助培土固本，以实脾土；另外白术健脾益气，燥湿化痰，正合“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”之意；郁金为入血之气药，有凉血止血、活血行气之功用；配合丹参凉血安神，四药共为臣药；煅龙骨与煅牡蛎合用，安神强魄，敛阳入阴［5］，配合女贞子、墨旱莲补益肝肾、调补阴阳，为佐使之药。诸药同用，共奏疏肝健脾、滋阴补肾、镇静安神之功效。此方为治疗不寐的基础方，临证时仍需根据患者体质进行加减化裁。

本研究系统地分析柴胡加龙骨牡蛎汤中的有效成分，通过构建中药-化合物-靶点网络图及拓扑学分析中得出Butin（紫铆黄酮）、Eriodictyol（圣草酚）、Oxycurcumenol（莪术烯醇）等是该方的关键化合物。其中已有部分成分被报道与抗氧化、保护脑神经有关，如紫铆黄酮具有显著的清除自由基及抗氧化作用，对脑损伤模型具有很好的保护作用［6-7］；圣草酚可以通过促进核因子E2 相关2（Nrf2）核转移发挥抗氧化、抗炎等作用［8］，另外还有神经保护作用，可预防神经退行性疾病的发生［9］。有实验研究表明，莪术烯醇可有效减轻PC12 细胞受到氧化应激时所致的细胞损伤［10］。

本研究对柴胡加龙骨牡蛎汤治疗不寐的PPI有效靶点进行了网络拓扑分析，发现了多个核心靶点，如TNF、CASP3、HSP90AA1、PPARG、ESR1等。为了明确柴胡加龙骨牡蛎汤的作用机制，本研究进一步做了GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，发现柴胡加龙骨牡蛎汤对药物的反应（response to drug）、ERK1和ERK2 级联的正向调节（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）、运动行为（locomotory behavior）以及神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligandreceptor interaction）、5-羟色胺能突触（Serotonergic synapse）、催乳素信号通路（Prolactin signaling pathway）等通路具有调节作用。其中神经活性配体-受体相互作用信号通路和5-羟色胺能突触都是重要的调节神经兴奋的信号通路，与失眠密切相关［11-12］。神经活性配体-受体互相作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路有关的受体和配体的合集，在受体和配体的信息传递中扮演重要角色［13］；5-羟色胺能突触可以通过调节大脑皮质和神经突触中抑制性神经递质5-羟色胺的含量来调节神经的功能，进而影响睡眠［14］。催乳素信号通路可参与多种生物学功能，包括免疫调节、泌乳、生长发育以及大脑和行为的调节［15］。柴胡加龙骨牡蛎汤可能是通过作用于这些通路而发挥治疗不寐的作用，为下一步研究提供了方向。

综上所述，本研究利用网络药理学及拓扑学分析方法初步验证了柴胡加龙骨牡蛎汤治疗不寐的药理作用，通过对柴胡加龙骨牡蛎汤的有效成分的初步挖掘，探索其治疗不寐的核心作用靶点及可能涉及的通路，为后续深入探讨奠定了基础。