血清miR-22检测在非小细胞肺癌预后中的临床价值研究

叶广彬，罗世官，张忠伟，黄 伟，凌 博

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中80%的肺癌患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。肺癌患者确诊时多为中晚期，且存在不同程度的转移，导致化疗、手术治疗等常规治疗方法的效果不理想，患者的5年生存期为10%～15%[1-4]。目前，病理活检为诊断肺癌的“金标准”，但其有创性、重复性差和肿瘤异质性等因素制约了肺癌临床诊断[5]。以分子标记物为代表的“液体活检”技术，成为解决上述问题的方案之一[6]。miR-22定位于人17号染色体上的17p13.3区域，在不同肿瘤中出现表达差异，参与肿瘤增殖、转移等进程[7]。血清miR-22在不同临床特征的NSCLC中出现差异化表达，具备作为辅助诊断NSCLC的生物标记物[8]。但miR-22与NSCLC临床各指标的相关性，以及在NSCLC预后中的价值尚不清楚。因此，该研究聚焦血清miR-22水平与NSCLC各临床特征和预后的相关性，探讨血清miR-22检测在NSCLC中的临床价值，以便通过液体活检技术为NSCLC患者的诊断和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集右江民族医学院附属医院和重庆市人民医院2010—2015年确诊的276例NSCLC患者临床资料，其中男性119例，女性157例，年轻患者31例(年龄≤50岁)，老年患者245例(年龄>50岁)。根据肿瘤原发部位分组，其中原发部位肺上叶113例、肺下叶137例、肺中叶12例、肺部但无法确定具体位置14例；根据肿瘤原发偏侧性分组，其中左侧113例、右侧163例；根据肿瘤分化分组，其中高分化135例、低分化35例、中分化106例；根据非小细胞肺癌AJCC分期第7版[9]，进行TNM分期，T分期中T1为104例、T2为81例、T3为59例、T4为32例；N分期中N0为194例、N1为19例、N2为49例、N3为14例；M分期中M0为210例，M1为66例；根据转移部位分组，其中肺内转移34例、肺癌肝转移11例、肺癌脑转移12例、肺癌骨转移19例。纳入的健康人群168例，其中男性70例，女性98例，年轻群体18例(年龄≤50岁)，老年群体150例(年龄>50岁)。健康人群和NSCLC患者在年龄和性别方面差异无统计学意义(P>0.05)。

健康人群准入标准：经过常规体检包括胸部CT等检查未发现肿瘤类疾病。排除标准：过往病历资料中出现过慢性支气管炎、肺结核、慢性阻塞性肺炎等慢性呼吸系统疾病和心脑血管疾病。NSCLC患者准入标准：依据组织病理活检或细胞病理检测确诊为原发NSCLC。排除标准：多原发癌、临床随访资料不完整或缺失、过往有肿瘤病史、确诊前进行化疗或放疗。

1.2 主要试剂EDTA抗凝管购于美国BD公司；miRNA提取试剂盒、miRNA逆转录cDNA试剂盒购于美国赛默飞公司；miRNA荧光定量PCR试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 qRT-PCR检测样本中miR-22的表达采集NSCLC患者和健康人群在入院当天空腹静脉血4 ml，应用抗凝剂乙二胺四乙酸二钾并离心10 min，转速5 000 r/min，取上清，应用miRNA提取试剂盒按照其操作程序提取血清样本中的miRNA。参照miRNA逆转录cDNA试剂盒的说明书，对miRNA的3′端poly(A)化和逆转录，其中以cDNA为模板，以miR-103a为内参，应用miRNA荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR检测。结果判读中，miR-22的相对表达量用2-ΔΔCt来确定。各组血清样本中的△Ct=Ct靶基因-Ct内参基因，Ct代表热循环仪在反应体系中检测到的荧光强度值。

miR-22引物序列为F:5′-GGGGGATCCCTGGG GCAGGACCCT-3′；R:5′-GGGGAATTCAACGTATCAT CCACCC-3′。

2 结果

2.1 NSCLC患者和健康人群血清中miR-22表达量变化NSCLC患者血清miR-22的平均表达量为(5.34 ±1.68)，健康人群血清miR-22的平均表达量为(2.85±0.73)。NSCLC患者血清miR-22的表达量明显高于健康人群，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 不同临床特征NSCLC患者血清中miR-22表达量的变化在年龄、性别、肿瘤原发部位、肿瘤原发偏侧性、T分期、肺癌脑转移中，NSCLC患者血清miR-22表达量无明显变化(P>0.05)；在肿瘤分化因素中，不同分化程度的患者血清miR-22水平有差异，其中低分化患者血清miR-22表达量高于高分化患者(P<0.05)；在N分期因素中，不同N分期的患者血清miR-22水平有差异，其中N3、N2期患者血清miR-22表达量高于N1、N0期(P<0.05)；在M分期因素中，M1期患者血清miR-22表达量高于M0期(P<0.05)；在肺癌骨转移因素中，肺癌骨转移患者血清miR-22表达量高于未骨转移的患者(P<0.05)；在肺癌肝转移因素中，肺癌肝转移患者血清miR-22表达量高于未肝转移的患者(P<0.05)；在肺内转移因素中，肺内转移患者血清miR-22表达量高于未肺内转移的患者(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床特征NSCLC患者血清中miR-22表达量的变化

2.3 NSCLC患者中血清miR-22表达量与临床特征的相关性以NSCLC患者血清miR-22平均表达量5.34进行分组，血清miR-22表达量>5.34为miR-22高表达组，血清miR-22表达量≤5.34为miR-22低表达组。结果NSCLC患者血清miR-22表达的高低与N分期、M分期、肺癌肝转移和肺内转移具有相关性(P<0.05)。N2期、N3期、M1期、肺癌肝转移和肺内转移的患者更易出现miR-22高表达。见表2。

表2 NSCLC临床特征与血清miR-22水平的相关性分析[n(%)]

2.4 生存分析血清miR-22水平对NSCLC预后的影响miR-22低表达的NSCLC患者预后优于miR-22高表达的患者，见图1。对患者的生存率和生存时间进行分析可知，miR-22低表达患者1、3、5年生存率和平均生存时间均高于miR-22高表达患者(P<0.05)，见表3、4。

图1 NSCLC患者血清miR-22水平与预后的相关性分析

表3 NSCLC患者血清miR-22水平与总生存率、生存时间的相关性分析

表4 NSCLC患者血清miR-22水平与肿瘤特异性生存率、生存时间的相关性分析

2.5 Cox多因素分析血清miR-22与NSCLC预后的相关性Cox多因素分析结果表明，T分期、M分期、肺癌骨转移、血清miR-22水平是NSCLC预后的独立因素。T3期、T4期、M1期、肺癌骨转移和血清miR-22高表达的NSCLC患者预后较差。见表5。

表5 NSCLC患者预后的Cox多因素分析

3 讨论

“液体活检”技术的兴起，成为肺癌等恶性肿瘤临床诊断的有效途径之一。液体活检具备无创性、呈现肿瘤异质性、实时性(监测肿瘤进程和预后)等优点，符合现代肿瘤“个性化治疗”的临床需要[10]。在液体活检技术中，以miRNA为代表的外周血分子诊断标记物，具备敏感性高和稳定性强等特点，但缺乏其与临床特征和预后的相关性研究，从而限制了其进一步开发[11]。因此，本研究试图以血清miR-22水平与NSCLC患者临床特征、预后的相关性入手，为miRNA在肿瘤液体活检中的开发提供可行性的方法和依据。

miR-22与NSCLC关系密切。多项研究指出[12-13]，miR-22通过抑制下游靶基因(癌基因)的转录后翻译环节，从而减少癌基因的表达，抑制NSCLC细胞的迁移、增殖。从血清表达水平的研究出发，不难发现miR-22在NSCLC患者的外周血中出现显著高表达，尤其在肿瘤分化、TNM分期、转移等因素中出现差异化表达[14]。本研究中在不同临床特征NSCLC患者血清miR-22表达也证实了以上观点。由此，miR-22参与了NSCLC的进程，且在不同临床特征患者中出现差异表达，这为miR-22开发成NSCLC液体活检中的分子靶标提供了依据。

目前miR-22与NSCLC患者临床特征的分析，主要集中在不同临床特征患者血清miR-22表达量，无法全面揭示miR-22与NSCLC临床特征的相关性[15]。因此，本研究中以NSCLC患者血清miR-22平均表达量分组，分析血清miR-22水平高低与临床特征的相关性。结果显示，血清miR-22水平高低与NSCLC患者N分期、M分期、肺癌肝转移和肺内转移具有相关性，且N2期、N3期、M1期、肺癌肝转移和肺内转移的患者更易出现miR-22高表达。此研究结果证实，血清miR-22水平与NSCLC患者的转移密切相关。

最新研究指出[16]，血清miR-22水平与NSCLC患者的总生存率和无病生存率具有相关性。然而血清miR-22在NSCLC患者预后中的价值还需进一步明确。因而，本研究纳入肿瘤特异性存活时间和总存活时间两个预后关键指标，进行评价血清miR-22水平在NSCLC预后中的价值。结果表明miR-22低表达患者1、3、5年生存率和平均生存期均高于miR-22高表达患者。由此，miR-22低表达的NSCLC患者预后优于miR-22高表达的患者。为了进一步挖掘血清miR-22水平在NSCLC预后中的价值，本研究利用Cox多因素回归分析的方法，纳入了年龄、性别、肿瘤原发部位、偏侧性、TNM分期、分级、肺癌骨转移和miR-22水平等因素，证实了血清miR-22水平是NSCLC独立的预后因素。以上结果也进一步证实了，血清miR-22水平可作为NSCLC预后分析的可靠性指标之一。