棘球蚴通过mTOR途径抑制糖酵解的研究

刘颖颖，孟娟娟，常 瑗，蔺 珂，廖 原，许军英，侯 隽，陈雪玲，王 仙

棘球蚴病(又称囊型包虫病)是细粒棘球绦虫幼虫寄生而引发的一种人兽共患病[1]。感染后，患者体内T细胞的分化出现偏移，表现出以Treg细胞为主的免疫抑制，但其机制尚不清楚[2]。代谢免疫学研究[3]表明，T细胞的分化与代谢选择有密切关系，效应T细胞采用有氧糖酵解 。调控糖酵解，可以影响T细胞的分化方向，上调糖酵解可促进Th17细胞分化，抑制Treg细胞的生成[4-5]。mTOR通路是调控糖酵解代谢中经典的能量代谢通路[6]。该研究通过构建棘球蚴感染小鼠的疾病模型，初步探讨mTOR途径是否参与调控T细胞的糖酵解代谢，为进一步研究在包虫病中糖酵解对宿主T细胞的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1小鼠与感染棘球蚴的羊肝来源 30只6～8周龄，体质量约为20 g的Balb/c小鼠，购于新疆医科大学实验动物中心；感染棘球蚴的羊肝来自新疆昌吉自治州屠宰场。

1.1.2主要试剂与仪器 RPMI-1640购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自以色列BI公司，小鼠脾脏淋巴细胞分离液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝公司，流式抗体、Fixation/Permeabilization Buffer、Brefeldin A(BFA)和逆转录试剂盒均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，Western blot抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，PMA/Ionomycin购自中国联科生物有限公司，总RNA提取试剂盒购自美国 Omega Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1提取原头蚴 清水多次冲洗感染棘球蚴的羊肝后，用75%乙醇喷洗消毒，以50 ml注射器抽取棘球蚴囊液，静置后留取沙粒样沉淀，用含有1%青-链霉素混合液的PBS冲洗10次，以除去残留囊皮和活性不好的原头蚴。将原头蚴吹打混匀后，吸取50 μl混合液滴加于载玻片上，然后加入5 μl伊红染液，混匀静置30 s，显微镜下观察计数，原头蚴活性>95%。

1.2.2构建棘球蚴感染小鼠模型 将30只健康Balb/c小鼠，随机分为对照组、感染组和抑制剂组，每组10只。感染组和抑制剂组肝被膜下接种5 000个原头蚴，对照组则接种同等体积的PBS。同时，抑制剂组从第2天起每日腹腔注射雷帕霉素(1.25 mg/kg)。

1.2.3采集外周血 摘除小鼠眼球收集血液，待血液凝固后，8 000 r/min，离心10 min，分装上层血清，-80 ℃冰箱保存，备用。

1.2.4制备脾脏淋巴细胞悬液 摘除小鼠脾脏，刮取脾脏细胞，将淋巴细胞分离液分离得到的细胞，用含10%胎牛血清的1640培养基制备成1×107/ml的细胞悬液，备用。

1.2.5Western blot检测mTOR途径的蛋白表达 提取蛋白样本，按照说明书配制一抗和二抗缓冲液，制备SDS-PAGE凝胶，4 ℃过夜，取出制胶梳，按照分组向孔内加入蛋白Marker(8 μl)或样本蛋白(20 μl)进行电泳，剪取适当大小的PVDF放入甲醇激活5 min，转膜，5% BSA封闭2 h，加入一抗缓冲液4 ℃慢摇过夜，1×TBST洗膜3次，每次计时10 min，孵育二抗1 h，1×TBST洗膜3次，每次计时10 min，将ECL发光试剂盒中的A液和B液，按照1 ∶1比例配制显色液，然后滴加在PVDF膜上，使显色液与膜上蛋白充分结合后，曝光，拍照及初步处理图像，Image J扫描条带蛋白灰度值。

1.2.6qRT-PCR检测糖酵解相关转录因子的mRNA表达 用试剂盒提取各组细胞总RNA后采用Nanodrop 2000测定浓度，逆转录成cDNA，按SYBR Green两步法操作进行qRT-PCR检测糖酵解代谢中酶以及乳酸转运蛋白：己糖激酶3 (hexokinase 3, HK3)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2, PKM2)、乳酸脱氢酶A(lactic dehydrogenase A, LDHA)和单羧酸转运蛋白4(mnocarboxylate transporter 4, MCT4)的mRNA表达。引物序列见表1，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行数据分析。

表1 相关引物序列

1.2.7流式细胞术检测Th17和Treg细胞 每组取1×106个脾脏淋巴细胞至各标记管中，按照标记分别加入 CD4-PE、CD25-Percpcy 5.5，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤1次，洗去未结合的抗体，固定、破膜后再按照标记分别加入IL-17A-FITC、FoxP3-FITC，各自4 ℃避光孵育30 min和40 min后，破膜液洗涤1次，加500 μl PBS重悬细胞，上机，Flowjo 10软件处理数据绘制图。

2 结果

2.1 原头蚴活性的测定在光学显微镜下可以观察到伊红染色后的原头蚴，着色为深红色的是已经凋亡的，未着色的为活性好的。见图1。

图1 不同视野下原头蚴伊红染色 ×40

2.2 棘球蚴感染小鼠肝脏的大体形态感染后，小鼠肝脏在15 d可见有乳白色囊泡形成，在30 d可见乳白色囊泡体积增大并凸起，70 d可见囊泡不仅体积增大，也向周围扩散，囊泡的数量增多，囊泡透明度增加并有囊液的形成。见图2。

图2 棘球蚴感染小鼠不同时间的肝脏

2.3 棘球蚴感染后糖酵解变化与mTOR途径的蛋白表达通过 qRT-PCR检测HK3、PKM2、LDHA和MCT4的mRNA表达反映糖酵解代谢的变化，如图3A所示，与对照组比较，棘球蚴感染后，感染组中糖酵解相关转录因子的mRNA表达水平降低，且均在感染后70 d达到最低，其中HK3(F=50.63，P<0.001)、PKM2(F=26.52，P<0.05)、LDHA(F=22.16，P<0.05)和MCT4(F=18.84，P<0.05)；感染后15、30和70 d各组mTOR下游分子的蛋白表达由Western blot检测，如图3B～E所示，各指标蛋白相对表达量分别为[HIF-1α (0.42±0.034)、 (0.11±0.006)、(0.18±0.006) 和 (0.01±0.003)，F=196.4，P<0.000 1；P-p70S6 (0.57±0.055)、(0.08±0.026)、(0.12±0.025)和(0.06±0.028)，F=87.76，P<0.000 1；P-4EBP-1 (0.58±0.071)、(0.19±0.056)、(0.28±0.028)和(0.15±0.058)，F=24.73，P<0.01]。与对照组比较，感染后HIF-1α、P-p70S6和P-4EBP-1的蛋白表达降低(均P<0.05)。

图3 棘球蚴感染后糖酵解变化与mTOR途径的蛋白表达

2.4 抑制mTOR途径对糖酵解的影响

2.4.1雷帕霉素抑制mTOR途径 对照组、感染组和抑制剂组中mTOR下游分子的蛋白表达由Western blot检测，各指标蛋白相对表达量分别为[HIF-1α (0.37±0.035)、(0.15±0.040) 和 (0.06±0.018)，F=59.24，P<0.05；P-p70S6 (0.86±0.007)、(0.26±0.024)和 (0.18±0.014)，F=649.30，P<0.01；P-4EBP-1 (0.73±0.020)、(0.31±0.021) 和 (0.19±0.008)，F=535.80，P<0.001]。与对照组比较，感染组和抑制剂组中淋巴细胞内mTOR下游分子的蛋白表达明显降低 (均P<0.05)。见图4。

图4 雷帕霉素抑制mTOR途径

2.4.2抑制mTOR途径对糖酵解代谢变化的影响 qRT-PCR检测HK3、PKM2、LDHA和MCT4的mRNA表达，与对照组和感染组比较，抑制剂组淋巴细胞内的糖酵解相关转录因子的mRNA表达水平明显降低，其中HK3(F=65.39，P<0.01)、PKM2(F=13.43，P<0.01)、LDHA(F=26.81，P<0.05)和MCT4(F=28.44，P<0.05)，见图5A。PMA/Inomycin和BFA刺激小鼠脾脏淋巴细胞5 h后，收集细胞，流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中Th17和Treg细胞的比例，在对照组、感染组和抑制剂组中CD4+IL-17A+(Th17)细胞的百分比分别是(5.60±0.49)%、(2.78±0.38)%和(1.26±0.06)%(F=67.79，P<0.01)；CD4+CD25+Foxp3+(Treg)细胞的百分比分别为(4.98±1.30)%、(10.96±0.45)%和(14.30±1.07)%(F=92.12，P<0.001)。与对照组和感染组比较，抑制剂组Th17细胞比例降低，Treg细胞比例升高(P<0.05)，见图5B～D。

图5 阻断mTOR对糖酵解代谢变化的影响

3 讨论

犬类作为终宿主排出含有虫卵的粪便，污染土壤、水流和食物，通过粪-口传播进入中间宿主体内，棘球蚴常寄生于肝脏和肺脏，形成一个囊状体，并随着寄生时间延长不断长大，压迫和破坏器官[7-8]。研究发现[9-10]，棘球蚴感染早期，机体的免疫应答以Th1和Th17细胞主导的炎症反应，有利于抗包虫的保护作用；感染晚期，机体的免疫应答向Th2细胞方向偏移，甚至出现Treg细胞负调控，免疫应答受到抑制，不利于虫体的清除。据报道[11-12]，有氧糖酵解在T细胞的增殖、分化和应答中有着至关重要的作用，当初始T细胞在抗原刺激后会广泛的活化，表现出糖酵解代谢加强，以及葡萄糖和氨基酸摄取的增加。即使在氧气充足的情况下，仍然是依靠糖酵解来生成ATP，从而快速有效地产生更多生物合成中间体，满足细胞迅速增殖的需求[13]。mTOR途径在细胞生长和增殖中发挥重要作用[14]，mTOR通过激活下游的HIF-1α，能够调控多种糖酵解基因的表达如：GLUT1、PKM2、LDHA 等[15]。但在棘球蚴感染中，糖酵解的作用以及mTOR途径和糖酵解之间的关系尚不清楚。通过本研究发现，棘球蚴感染后，T细胞内mTOR的下游分子蛋白表达降低，糖酵解相关转录因子的mRNA表达降低，运用雷帕霉素阻断mTOR途径后，观察糖酵解的变化，结果显示糖酵解代谢明显抑制，提示棘球蚴感染可能通过mTOR途径抑制了T细胞内糖酵解代谢。因此，在棘球蚴感染中棘球蚴对宿主免疫的免疫抑制，可能与mTOR途径抑制糖酵解有关。

此外，流式细胞术检测了脾脏组织CD4+T细胞中Th17和Treg细胞的比例，发现当阻断mTOR引起糖酵解代谢减弱时，Th17/Treg细胞平衡偏移，但具体糖酵解在棘球蚴感染中如何影响T细胞的分化，进而影响宿主免疫反应，还需要进一步研究。