丹红注射液对急性心肌梗死大鼠的治疗性血管新生作用研究

卫 国，王慧芳，刘 娟，刘迎宾，王艳华，殷 英

近年来，通过给予药物或血管新生调节因子等外源性干预措施促进血管新生即治疗性血管新生，逐渐成为冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery heart disease，CAHD)治疗的重点关注领域[1]。中药因其多靶点、多机制、安全性高等优势，在CAHD治疗性血管新生疗法中愈来愈受到关注[2]。丹红注射液(danhong injection，DHI)是由丹参和红花两味传统中药按一定比例配伍制成的中药注射剂，具有通脉生络，去瘀生新的功效，能有效治疗血脉痹阻所致的“胸痹”或者“真心痛”。但目前DHI对缺血心肌的保护作用与其“生新”功能的相关性研究较少，该研究主要考察DHI对急性心肌梗死(acute myocardium infarction，AMI)大鼠缺血心肌的保护作用和对冠状动脉血管新生的促进作用，从而明确DHI对AMI损伤是否具有治疗性血管新生作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量250～280 g，由空军军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK- (军)2012-0007。

1.1.2仪器与设备 HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技公司)；BL-420S系列生物机能实验系统(成都泰盟科技公司)；IX71+DP72型倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；Vevo 770型小动物超声波影像诊断仪(加拿大 visualsonics公司)；LMT260-XY图像采集系统(德国Leica公司)；CHEMIDOC凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；5804R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

1.1.3试药与试剂 DHI(10 ml/支，批号：14121025)由山东丹红制药有限公司生产；伊文思蓝(evans blue，EB)、2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑蓝(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)购自美国Sigma公司；T型肌钙蛋白(troponin T，TN-T)试剂盒、脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；兔抗大鼠血小板-内皮细胞黏附分子(cell adhesion 34，CD34)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、血管假性血友病因子(von willebrand factor，vWF)、兔抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(alpha-Smooth muscle actin，α-SMA)、兔抗大鼠β-肌动蛋白(beta-actin，β-actin)一抗购自美国Cell Signaling公司；过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗购自美国Abcam公司；水合氯醛、多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1动物分组与给药 40只大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、DHI低(0.5 ml/kg)、中(1.0 ml/kg)、高(2.0 ml/kg)剂量组；每组8只。造模24 h后给药，尾静脉注射，每天一次，模型组和假手术组给予生理盐水(2 ml/kg)，连续给药7 d后取材。

1.2.2大鼠AMI模型制备 大鼠称重，按4 ml/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧位固定于专用木板上，连接生物机能实验系统，记录标准Ⅱ导联心电图；行气管插管术并连接呼吸机，设置呼吸机参数(频率：75次/min；潮气量：8～9 ml；呼吸比=2 ∶1)；于第3～5肋间开胸，充分暴露心脏，剪开心包膜，于左心耳下方1～2 mm处进针，绕左冠状动脉前降支穿线、结扎；以大鼠心脏左室前壁变白且心电图ST段出现明显抬高(幅度>0.2 mV)，表明模型建立成功；关闭胸腔，排除胸腔气体，逐层缝合。待大鼠恢复自主呼吸，撤去呼吸机，将大鼠置温箱中，待其自然苏醒。术后每只大鼠按150万U/(kg·d)腹腔注射青霉素，连续3 d，以预防感染。

1.2.3心功能测定 采用超声心动图法评价大鼠心功能。术前及末次给药后6 h测定，以二维超声(频率 15 MHz)和 M 型超声检测左室收缩功能指标，记录左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)，计算大鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。各参数均计算 3 个心动周期的平均值。

1.2.4取材与样本处理 每组剩余存活大鼠第2次心功能测定完毕后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血2 ml，供血清生化指标测定；随后处死大鼠，取出心脏，剪取左心室梗死区域边缘心肌组织，分为2份，一份置-80 ℃保存，供免疫印迹实验用；另一份4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水、石蜡包埋，切片，供免疫组化(HE染色和CD34染色)实验用。

1.2.5血清生化指标测定 采用酶联免疫法测定，从大鼠腹主动脉抽血2 ml至肝素管，静置15 min，3 000 r/min离心20 min，留血清，按照试剂盒说明书中的操作步骤测定其中的TN-T和BNP含量。

1.2.6HE染色 取“1.2.4”中制备的石蜡切片，脱蜡至水，苏木精染色，水洗后盐酸乙醇分化，自来水冲洗，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，在光学显微镜下观察心肌梗死边缘区心肌细胞。

1.2.7微血管密度(microvessel density，MVD)测定 取“1.2.4”中制备的石蜡切片，采用免疫组化法(SP法)染色，DAB显色，其中CD34抗体浓度为1 ∶200；用抗体稀释液代替一抗作为阴性对照。染色后，先用低倍镜(×40视野下)扫视玻片，找到梗死边缘区血管密度最高的区域，然后在高倍镜下(×400视野下)计数视野内被染色的血管数。凡呈棕黄色的单个血管内皮细胞或细胞簇均被计数，但管腔>25 μm的血管除外。计算单位面积内微血管的数量，即MVD，随机选取5个视野/张，计算平均值。

1.2.8蛋白表达测定 采用免疫印迹(Western blot)法测定。取“1.2.4”中-80 ℃保存心肌组织，剪碎，冰浴条件下，加入蛋白裂解液裂解，冷冻离心机中(4 ℃，12 000 r/min)离心20 min，取上清，用考马斯亮兰蛋白定量试剂盒定量；煮沸法行蛋白变性后取等量蛋白经SDS-PAGF电泳分离，转至PVDF膜上，37 ℃下脱脂奶粉封闭，加入1 ∶1 000稀释的vWF、α-SMA、VEGF-A、β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，加入1 ∶5 000稀释的羊抗兔的二抗，37 ℃孵育30 min，ECL发光显色，凝胶成像系统进行摄影分析。蛋白表达以目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值表示，各组蛋白相对水平以其对假手术组倍数表示。

2 结果

2.1 大鼠存活情况给药结束后，40只大鼠存活34只，假手术组、模型组、DHI低、中、高剂量组大鼠分别死亡0、1、2、2和1只，死亡原因包括麻醉意外、心律失常和呼吸衰竭，各组死亡率差异无统计学意义。

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2.2 DHI对AMI大鼠心功能的影响术前各组大鼠心功能比较差异无统计学意义；造模7 d后，假手术组大鼠心功能与术前比较差异无统计学意义；与假手术组大鼠LVEF(79.00±3.10)%和LVFS(39.83±3.92)%比较，模型组大鼠LVEF(35.33±4.32)%和LVFS(19.83±3.60)%下降(P<0.01)；DHI能剂量依赖性的升高大鼠LVEF和LVFS值，其中，中剂量组[LVEF(50.67±3.01)%，LVFS(26.17±2.64)%]、高剂量组[LVEF(56.00±4.82)%，LVFS(29.33±4.23)%]大鼠心功能与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图1。

图1 超声心动图法检测DHI对AMI大鼠心功能的影响

2.3 DHI对AMI大鼠血清TN-T和BNP水平的影响造模7 d后，模型组血清TN-T(6.30±0.68)ng/ml和BNP(125.33±6.71)pg/ml含量仍高于假手术组TN-T(0.27±0.12)ng/ml和BNP(28.83±3.87)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.01)；而给予不同剂量的DHI治疗后，大鼠血清TN-T[低：(5.72±0.45) ng/ml、中：(4.78±0.47) ng/ml、高：(3.43±0.45) ng/ml]和BNP[低：(115.17±6.18) pg/ml、中：(105.17±5.23) pg/ml、高：(94.83±5.04) pg/ml)]水平均下降，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图2。

图2 ELISA法检测 DHI对AMI大鼠血清TN-T和BNP含量的影响A：各组血清TN-T含量；B：各组血清BNP含量；与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较： #P<0.05，##P<0.01

2.4 DHI对AMI大鼠心肌病理的影响假手术组心肌纤维排列整齐，结构正常；模型组大鼠心肌细胞大量坏死，肌纤维断裂，可见大量炎性细胞浸润；给予不同剂量DHI治疗后，心肌细胞坏死程度，组织炎性细胞浸润程度均有不同程度改善。见图3。

图3 HE染色法检测DHI对AMI大鼠心肌病理损伤的影响 ×200 A：假手术组; B：模型组; C：低剂量组; D：中剂量组; E：高剂量组

2.5 DHI对AMI大鼠心梗边缘区MVD的影响造模7 d后，各实验组大鼠心肌梗死边缘区均可发现CD34阳性细胞或细胞簇，即新生微血管；模型组新生血管数量即MVD值(16.80±3.03)n/mm2，较假手术组(7.60±1.82)n/mm2有增加，差异有统计学意义(P<0.01)；三个剂量的DHI治疗能不同程度的促进微血管新生，与模型组比较，中(33.60±5.86)n/mm2、高(50.60±4.51)n/mm2剂量组心肌梗死边缘区MVD值增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

图4 免疫组化法检测DHI对AMI大鼠心肌梗死边缘区MVD的影响与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01

2.6 DHI对AMI大鼠心梗边缘区vWF、α-SMA和VEGF-A表达的影响与假手术组(1.00±0.00)比较，模型组大鼠心肌梗死边缘区vWF(2.14±0.46)、α-SMA(1.80±0.25)和VEGF-A(1.90±0.48)表达均有不同程度升高，两组间差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；DHI治疗则能更进一步促进这三种蛋白的表达，中、高剂量组vWF[(3.20±0.71)、(5.62±0.70)]表达高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；低、中、高剂量组的α-SMA[(2.50±0.56)、(3.10±0.66)、(5.24±0.67)]和VEGF-A[(2.50±0.43)、(4.28±0.34)、(6.52±0.56)]表达均高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图5。

图5 Western blot法检测DHI对AMI大鼠心肌梗死边缘区vWF、α-SMA和VEGF-A表达的影响

3 讨论

血管新生在CAHD治疗中地位日渐提高。因长期心肌缺血导致心肌细胞死亡、心肌局灶性或弥漫性的纤维化以及心室重构，进而引起心肌舒缩功能障碍是CAHD的主要病理机制[3]；而冠状动脉血管新生信号的激活能促进缺血心肌侧支循环的建立，有助于恢复血供，从而挽救顿抑心肌、抑制心肌细胞死亡，减少心肌结构性和功能性损伤。当发生心肌梗死时，缺血心肌会适应性的表达促血管新生因子，促进血管再生，但这种内源性的代偿机制作用十分有限[4]；因此，通过各种方法适当的给予外源性促血管新生药物，调节缺血心肌血管新生相关分子的表达，提升心肌的血管再生能力，即治疗性血管新生成为目前CAHD治疗的研究热点。中药因其多靶点、多机制、安全性高等优势，在CAHD治疗性血管新生疗法中愈来愈受到关注。

目前基础研究中多采用结扎、给药、介入、冷冻等方法制作心肌梗死模型，其中，冠状动脉结扎法因为可以最大限度模拟临床，而且更加符合心肌梗死的实际病理过程，是心肌梗死模型最为经典和常用的制作方法[8]。本研究即通过结扎大鼠冠状动脉左前降支制作AMI模型来考察DHI的治疗性血管新生作用。心功能的变化与心肌缺血损伤程度和心脏的工作性能密切相关，而大鼠心脏LVEF和LVFS以及血清TN-T和BNP水平[9-10]都是表征大鼠的心功能的关键指标。本研究结果表明，DHI能明显抑制AMI引起的大鼠心脏LVEF和LVFS下降以及血清TN-T和BNP含量的增加，且呈剂量依赖性。这些结果提示，DHI能减少大鼠心肌缺血损伤，改善大鼠心功能，发挥心肌保护作用。文献证实，CD34、vWF、α-SMA都是微血管的标志性分子[11-12]，本研究首先即考察了DHI对这些分子表达的影响。结果表明，DHI能剂量依赖性的增加心梗大鼠左室梗死边缘区CD34阳性细胞标记的MVD以及vWF和α-SMA蛋白的表达。此外，VEGF-A是调节血管新生的关键信号分子，DHI亦能显著上调大鼠左室梗死边缘区VEGF-A蛋白的表达，提示DHI可以显著促进大鼠缺血心肌的冠状动脉血管新生。

综上所述，DHI能够减少AMI引起的大鼠心肌缺血损伤，改善大鼠心功能，其机制可能与其促血管新生作用相关。