基于硫氧还蛋白还原酶1探究堆心菊灵对人前列腺癌细胞中活性氧产生的影响

潘聪桃，张晓燕，廖爱玲，潘海飞，周超峰，杨 宇*

基于硫氧还蛋白还原酶1探究堆心菊灵对人前列腺癌细胞中活性氧产生的影响

潘聪桃1，张晓燕2，廖爱玲2，潘海飞3，周超峰2，杨 宇2*

1. 温州市中心医院 麻醉手术科，浙江 温州 325000 2. 温州医科大学附属第一医院 泌尿外科，浙江 温州 325000 3. 温州医科大学附属第一医院 麻醉手术室，浙江 温州 325000

探究堆心菊灵在人前列腺癌细胞中的抗癌作用及其潜在的作用机制。人前列腺癌DU145和PC-3细胞分别以不同浓度的堆心菊灵处理48 h，CCK-8法检测细胞存活率；qRT-PCR法检测硫氧还蛋白还原酶1（thioredoxin reductase 1，）mRNA表达情况。从人类蛋白免疫组化表达数据库中检测前列腺癌组织和正常组织中TrxR1蛋白表达情况；经堆心菊灵或活性氧（reactive oxygen species，ROS）抑制剂处理后，采用DCFH-DA染色法检测ROS的产生；敲除或过表达，经堆心菊灵处理后，检测2种细胞中ROS水平。堆心菊灵显著抑制前列腺癌细胞存活率和mRNA表达水平（＜0.05、0.001），呈剂量相关性。与正常组织相比，TrxR1在前列腺癌组织中高表达。堆心菊灵显著诱导了前列腺癌细胞中ROS的产生，敲除显著提高了前列腺癌细胞中ROS水平，过表达TrxR1抑制了前列腺癌细胞中ROS产生；而堆心菊灵可改善TrxR1过表达对ROS产生的抑制作用。堆心菊灵可以通过靶向人前列腺癌细胞中的TrxR1来促进ROS的产生，进而发挥抗前列腺癌的作用。

堆心菊灵；硫氧还蛋白还原酶1；活性氧；前列腺癌细胞；抗癌

前列腺癌是中国男性中最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。雄激素剥夺疗法是前列腺癌的首选治疗方法[2]。然而，一部分前列腺癌患者对该治疗不敏感，限制了该疗法在临床上的应用。因此，迫切需要探索用于治疗该疾病的新型药物。

氧化应激参与调节肿瘤细胞的恶性生物学行为。尽管从正常的生理角度来看，维持细胞功能所需的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平是必要的，但过量的ROS可能破坏促氧化剂和抗氧化剂的平衡，从而导致细胞损伤或死亡[3]。氧化应激水平的提高已成为消除肿瘤细胞的一种有前景的治疗策略。与正常细胞相比，前列腺癌细胞中ROS和氧化应激水平增加[4]。研究报道，促进ROS的产生可以显著地杀伤前列腺癌细胞[5]。硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）系统包含硫氧还蛋白受体（thioredoxin receptor，TrxR）、Trx和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）。研究表明，抑制TrxR1的活性会破坏细胞的氧化还原平衡，从而导致ROS的升高[6]。

堆心菊灵是愈创木酚内酯的天然产物。近年来研究发现堆心菊灵具有抗炎[7]、抗氧化应激[8]和抗肿瘤[9]等多种药理活性。然而，堆心菊灵是否能够治疗前列腺癌尚不清楚。此外，堆心菊灵抗癌的作用机制尚未完全阐明。本研究旨在探索堆心菊灵对前列腺癌细胞的影响，并探讨堆心菊灵是否可以通过靶向TrxR1促进前列腺癌细胞中ROS产生。

1 材料

1.1 细胞

人前列腺癌细胞系DU145和PC-3购自美国ATCC。

1.2 药品与试剂

堆心菊灵（批号236784P）购自孟成科技（上海）有限公司；RPMI 1640培养基（批号25123404）购自武汉普诺赛公司；胎牛血清（批号2085124A）购自美国Hyclone公司；F-12K培养基（批号2173969RP）购自美国Gibco公司；PBS溶液（批号1036741）购自美国Life Carlsbad公司；CCK-8检测试剂盒（批号2148751）购自上海东仁化学公司；MiniBEST通用RNA提取试剂盒（批号2173969RP）购自日本Takara公司；Lipofectamine 2000（批号2036945B）购自美国Invitrogen公司；ROS检测试剂盒（批号20210514）购自北京索莱宝科技有限公司；多聚甲醛（批号20210311）购自上海生工生物工程公司；山羊血清（批号04569）购自北京Beyotime公司；Triton X-100（批号20210412）、DAPI染液（批号20210311）购自美国Sigma公司。

1.3 仪器

荧光显微镜（日本Olympus公司）；全功能微孔板检测仪（美国PerkinElmer公司）；qRT-PCR仪（美国ABI公司）；细胞爬片（无锡NEST公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

DU145细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，PC-3细胞用含10%胎牛血清的F-12K培养基，培养基中均含100 U/mL青霉素和链霉素，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。

2.2 TrxR1过表达载体的构建

利用TrxR1特异性引物将目的基因编码区序列（CDS）克隆，包括PCR扩增、产物纯化、限制性内切酶酶切，利用T4 DNA连接酶进行连接；转化大肠杆菌DH5a，进行菌落PCR。选取阳性样品进行摇菌测序，比对正确的菌落保存备用，并提取质粒。

2.3 细胞存活率检测

通过CCK-8试剂盒检测前列腺癌细胞的存活率。DU145和PC-3细胞经PBS溶液冲洗后，用胰蛋白酶消化2 min，制成细胞悬液，将细胞以8000个/孔接种到96孔板中，细胞培养至贴壁后，向细胞中加入不同浓度的堆心菊灵（0、1、2、4、8、12、16、20 μmol/L），培养48 h；加入CCK-8溶液，孵育3 h，加入终止溶液，采用全功能微孔板检测仪测定450 nm处的吸光度（）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(实验－空白)/(对照－空白)

2.4 转染

DU145和PC-3细胞以1×104/孔接种到6孔板中，培养24 h后，用Liopfectamine RNAiMAX试剂将20 μmol/L si-及无关序列（si-NC）转染到细胞中。siRNA序列：si-#1：5’-GGGGAAGACCCTGGTTGTT-3’；si-#2：5’-CCACTGTATTTACTCCTTT-3’。此外，将编码TrxR1蛋白的重组质粒载体通过Lipofectamine 2000分别转染到DU145和PC-3细胞中。24 h后，采用qRT-PCR评估转染效果。

2.5 qRT-PCR检测

使用RNA提取试剂盒从DU145和PC-3细胞中提取总RNA。用紫外分光光度计测量260/280值。将总RNA逆转录成cDNA：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。通过qRT-PCR检测目标基因的表达。引物序列：人上游引物5’-CCCT- GGTTGTTGGAGCAT-3’，下游引物5’-TCTGA- GTCGGCCTGGTGT-3’；人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）上游引物5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物5’-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。

2.6 ROS检测

采用ROS检测试剂盒检测DU145和PC-3细胞中ROS水平。取处于对数生长期的细胞，以1×104/孔接种到24孔板中，细胞贴壁生长后，用ROS抑制剂-乙酰半胱氨酸（NAC，10 mmol/L）预处理1 h，然后加入堆心菊灵处理48 h。用无血清培养基按1∶1000稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol/L，将细胞与300 μL DCFH-DA于37 ℃孵育30 min；于PBS溶液中浸泡后，用4%多聚甲醛固定15 min；将载玻片用0.5% Triton X-100于室温浸透20 min，滴加山羊血清，室温封闭30 min；加入DAPI染液，避光孵育5 min，用载有抗荧光淬灭剂的固定溶液固定载玻片，于荧光显微镜下观察并拍照。同法检测敲除或过表达TrxR1后细胞内的ROS水平。

2.7 统计分析

3 结果

3.1 堆心菊灵抑制人前列腺癌细胞的存活率

用不同浓度的堆心菊灵处理DU145和PC-3 2种前列腺癌细胞，如图1所示，随着堆心菊灵浓度的增加，DU145和PC-3细胞的存活率逐渐降低。本研究选择8 μmol/L作为堆心菊灵处理DU145细胞的最佳浓度[半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）＝6.12 μmol/L]，4 μmol/L作为堆心菊灵处理PC-3细胞的最佳浓度（IC50＝5.32 μmol/L）。

3.2 TrxR1在前列腺癌组织中高表达

从人类蛋白免疫组化表达数据库（https://www. proteinatlas.org/）中搜索了TrxR1在人前列腺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况。如图2所示，TrxR1在人前列腺癌组织中染色较深，并且多位于细胞质和细胞膜上（棕黄色）；在细胞核（蓝色）上没有染色；而在癌旁正常组织中没有着色现象。表明与癌旁正常组织相比，TrxR1在人前列腺癌组织中显著高表达，并且TrxR1主要在细胞质和细胞膜上表达。

与堆心菊灵（0 μmol·L−1）组比较：***P＜0.001

图2 TrxR1在人前列腺癌和癌旁正常组织中的表达情况

3.3 堆心菊灵抑制TrxR1在人前列腺癌细胞中的表达

用不同浓度的堆心菊灵处理DU145和PC-3 2种前列腺癌细胞，采用qRT-PCR检测细胞中mRNA表达水平。如图3所示，随着堆心菊灵浓度的增加，DU145和PC-3细胞中mRNA表达水平逐渐降低。表明堆心菊灵可以抑制在人前列腺癌细胞中的表达，且呈剂量相关性。

与堆心菊灵（0 μmol·L−1）组比较：*P＜0.05 ***P＜0.001

3.4 堆心菊灵促进人前列腺癌细胞中ROS的产生

进一步分析堆心菊灵是否可以调节人前列腺癌细胞中ROS的产生，进而诱导前列腺癌细胞的凋亡。如图4所示，与对照组相比，堆心菊灵能够升高DU145和PC-3细胞中ROS水平；2种前列腺癌细胞经ROS抑制剂NAC预处理1 h可以明显减弱堆心菊灵诱导的ROS升高。表明堆心菊灵促进人前列腺癌细胞中ROS的产生。

3.5 沉默TrxR1表达促进人前列腺癌细胞中ROS的产生

为了沉默的表达，设计了2个靶向TrxR1的siRNAs并分别转染到DU145和PC-3细胞中。qRT-PCR结果（图5-A、B）表明，2个siRNAs均有效地抑制了2种细胞中的表达，其中si-#1敲除效果更佳。因此，选取si-#1用于接下来的实验。敲除后，通过DCFH-DA染色检测DU145和PC-3细胞中ROS的产生，如图5-C所示，与si-NC组相比，si-1组2种前列腺癌细胞ROS水平明显升高。表明沉默促进人前列腺癌细胞中ROS的产生。

3.6 堆心菊灵通过靶向TrxR1促进人前列腺癌细胞中ROS的产生

为了过表达DU145和PC-3细胞中的TrxR1，将编码TrxR1蛋白的重组质粒转染到前列腺癌细胞中。qRT-PCR结果（图6-A、B）显示，TrxR1在DU145和PC-3细胞中被过表达。DCFH-DA染色结果（图6-C）显示，TrxR1过表达明显抑制了前列腺癌细胞中ROS的产生，堆心菊灵能够明显改善前列腺癌细胞中由于TrxR1过表达导致的ROS减少。表明堆心菊灵通过靶向TrxR1促进人前列腺癌细胞中ROS的产生。

图4 堆心菊灵促进人前列腺癌细胞中ROS的产生

qRT-PCR法检测DU145 (A) 和PC-3细胞(B) 中siRNAs靶向TrxR1的敲除效果 经si-NC或者si-TrxR1转染后，DCFH-DA染色法检测DU145 (C) 和PC-3细胞(D) 中ROS的产生 与si-NC组比较：***P＜0.001

4 讨论

堆心菊灵在人类多种癌细胞中均表现出有效的抗癌效果，但其对前列腺癌的作用及机制尚不清楚。本研究考察了堆心菊灵在DU145和PC-3细胞2种前列腺癌细胞中的抗癌作用，发现堆心菊灵可以通过靶向TrxR1促进前列腺癌细胞ROS的产生，进而发挥抗癌作用，表明堆心菊灵可能是一种有前景的抗前列腺癌药物。

研究报道，MHY440可以通过ROS依赖的DNA损伤，促进胃癌细胞的凋亡和细胞周期阻滞[10]；Brosimone I可能通过ROS介导的内质网应激促进大肠癌细胞的凋亡和G1细胞周期阻滞[11]。本研究结果显示，堆心菊灵可以诱导前列腺癌细胞中ROS的产生。研究发现，堆心菊灵可以减轻急性肝损伤小鼠中ROS的产生[8]。ROS可作为由堆心菊灵诱导的实体瘤细胞死亡的关键介质[12]。然而，经ROS抑制剂预处理后，堆心菊灵对前列腺癌细胞的抑制作用被减轻。因此，堆心菊灵是否通过诱导ROS的产生进而促进前列腺癌的凋亡和细胞周期阻滞，需要更多的研究来验证。

TrxR是肿瘤的一个关键的治疗靶点[13]。TrxR1与前列腺癌的发生和发展有关。与正常组织相比，TrxR1在前列腺癌组织显著高表达。靶向TrxR1可以改善前列腺癌患者的预后[14]。本研究结果显示，堆心菊灵降低了DU145和PC-3细胞中的表达，且呈剂量相关性。因此，TrxR1可能是堆心菊灵的潜在靶点。研究报道，抑制TrxR1可以诱导ROS在胃癌细胞中的积累[15]。敲低后，在DU145和PC-3细胞中发现了相似的结果；过表达TrxR1降低了ROS的产生。据报道，抑制TrxR1可以刺激乳腺癌[16]和肝细胞癌[17]的内质网应激依赖性的细胞凋亡。因此，堆心菊灵可以通过降低前列腺癌细胞中TrxR1的表达来促进ROS的产生，进而促进前列腺癌细胞凋亡。

qRT-PCR法检测DU145 (A) 和PC-3细胞(B) 中TrxR1过表达的效果 经TrxR1过表达质粒或者堆心菊灵处理后，DCFH-DA染色法检测DU145 (C) 和PC-3细胞(D) 中ROS的产生 与空质粒组比较：***P＜0.001

综上所述，堆心菊灵能够通过靶向TrxR1发挥抗前列腺癌作用，其作用机制可能与ROS介导的细胞凋亡和细胞周期阻滞有关。堆心菊灵可能是一种有前景的抗前列腺癌药物，值得更深入的研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effect of helenalin on reactive oxygen species in human prostate cancer cells based on thioredoxin reductase 1

PAN Cong-tao1, ZHANG Xiao-yan2, LIAO Ai-ling2, PAN Hai-fei3, ZHOU Chao-feng2, YANG Yu2

1. Department of Anesthesia Surgery, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou 325000, China 2. Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 3. Department of Anesthesia Surgery, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China

To explore the anticancer effect and potential mechanism of helenalin in human prostate cancer cells.Human prostate cancer DU145 and PC-3 cells were treated with different concentrations of helenalin for 48 h, and cell viability was detected by CCK-8 method, thioredoxin reductase 1 () mRNA expression was detected by qRT-PCR method. The protein expression of TrxR1 in prostate cancer tissues and normal tissues was detected by human protein immunohistochemical expression database; After treated with helenalin or reactive oxygen species (ROS) inhibitors, the production of ROS was detected by DCFH-DA staining; Knockout or overexpression of TrxR1, ROS levels in two kinds of cells after treated with helenalin were detected.Helenalin significantly inhibited the survival rate of prostate cancer cells andmRNA expression (< 0.05, 0.001), with a concentration-dependent manner. Compared with normal tissues, TrxR1 is highly expressed in prostate cancer tissues. Helenalin significantly induced ROS production in prostate cancer cells, knockdown ofsignificantly increased ROS level in prostate cancer cells, and overexpression of TrxR1 inhibited the production of ROS in prostate cancer cells.Helenalin can promote the production of ROS by targeting TrxR1 in human prostate cancer cells, thereby exerting an anti-prostate cancer effect.

helenalin; thioredoxin reductase 1; reactive oxygen species; prostate cancer cells; anticancer

R285.5

A

0253 - 2670(2022)07 - 2078 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.017

2021-12-17

温州市科技计划经费自筹项目（Y20180481）

潘聪桃，主管护师，本科，研究方向为泌尿系统肿瘤护理。E-mail: 435569205@qq.com

杨 宇，主治医师，硕士研究生，研究方向为泌尿系统肿瘤。E-mail: 83292199@qq.com

[责任编辑 李亚楠]