基于外周血单个核细胞转录组学的柴归颗粒抗抑郁作用机制研究
2022-03-31王力文黄德华田俊生高晓霞秦雪梅杜冠华周玉枝
王力文，黄德华，田俊生，高晓霞，秦雪梅，杜冠华，周玉枝*
• 药理与临床 •
基于外周血单个核细胞转录组学的柴归颗粒抗抑郁作用机制研究
王力文1, 2, 3，黄德华1, 2, 3，田俊生1, 2, 3，高晓霞1, 2, 3，秦雪梅1, 2, 3，杜冠华1, 4，周玉枝1, 2, 3*
1. 山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006 2. 山西大学 化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006 3. 地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室，山西 太原 030006 4. 中国医学科学院，北京协和医学院药物研究所，北京 100050
通过转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）技术分析柴归颗粒对慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的转录组学特征，并采用qRT-PCR法验证其作用机制。将大鼠随机分为对照组、模型组、盐酸文拉法辛（35 mg/kg）组和柴归颗粒低、中、高剂量（4.2、8.3、16.6 g/kg）组，造模同时给药，连续28 d。通过抑郁症传统药效学指标（体质量、旷场实验、糖水偏爱实验及强迫游泳实验）评价柴归颗粒的药效。采用RNA-seq技术对大鼠PBMCs进行转录组学分析，筛选差异基因，对其进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析；通过qRT-PCR法对筛选出的关键表达基因进行实验验证。行为学指标显示柴归颗粒能显著改善CUMS模型大鼠的抑郁行为。转录组学中KEGG通路富集分析表明抑郁发生时及柴归颗粒干预后，都显著富集到嘌呤代谢通路，因此针对嘌呤代谢相关代谢酶基因表达进行深入研究。qRT-PCR结果表明，与模型组比较，柴归颗粒组大鼠PBMCs中的胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3，）、胞质-5′-核苷酸酶IIIA（cytosolic-5′-nucleotidase IIIA，）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，）、腺苷酸脱氨酶（adenosine deaminase，）mRNA表达水平显著升高（＜0.05、0.01、0.001），黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，）、嘌呤能受体P2X7（purinergic receptor P2X7，）、白细胞介素1β（interleukin 1β，）mRNA表达水平显著降低（＜0.05、0.01）。柴归颗粒具有抗抑郁作用，其作用机制与调节嘌呤代谢途径上的基因及嘌呤能受体和炎症因子mRNA表达有关。
柴归颗粒；慢性不可预知温和应激抑郁；外周血单个核细胞；转录组学；嘌呤代谢
根据世界卫生组织的数据，抑郁症是一种常见的精神障碍，影响着全球3亿多人口。抑郁症也是自杀的一个危险因素。2017年，世界卫生组织宣布自杀是15～29岁年轻人的第2大死因，并预测抑郁症将是未来10年世界上最常见的精神疾病[1]。临床抗抑郁药物以化学药为主，其优势在于起效较快，疗效确切，不足在于不良反应较大，患者对药物存在依赖性，复发率较高；而中药的药效稳定且不良反应少，安全性高。现代药理学研究表明，多种中药复方[2-3]均有显著的抗抑郁作用。因此，从中药和天然药物中研究和开发新药，对抑郁症的治疗和创新药物的开发有重要意义。柴归颗粒是本课题组经过前期对经典方剂逍遥散最佳抗抑郁组分进行药效学筛选和抗抑郁物质基础研究，并通过药效成分归属和临床观察对原方进行化裁而研发的抗抑郁中药新药，其处方由柴胡、当归、白芍、麸炒白术、炙甘草、薄荷6味中药组成。柴归颗粒已获得国家药物临床试验批件（2018L03149），多种抑郁动物模型均证明该药具有确切的抗抑郁作用[4-7]，目前正在开展药物临床试验研究[8]。然而，柴归颗粒抗抑郁作用机制尚未明确。
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是由外周血中淋巴细胞和单核细胞等具有单个核的细胞组成（以淋巴细胞为主）。PBMCs在免疫应答、代谢、与其他细胞和细胞外基质的通讯等方面发挥着重要作用[9-11]。炎症及免疫反应在抑郁症的发病机制中起重要作用。因此，与血清/血浆样本相比，以免疫细胞为主的PBMCs对于研究抑郁症的发生与免疫之间的联系更具有说服力。目前，已有大量的临床试验样本证据表明PBMCs的基因改变与抑郁症的关系非常密切。如崔雪莲[12]以抑郁症和健康人的PBMCs为研究对象，用人类LncRNA3.0芯片初步筛查，结果发现6个LncRNAs有潜力作为抑郁症的诊断标志物，其中一个LncRNA（NONHSAG045500）与5-羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）的表达密切相关，可作为抗抑郁新型药物的靶点。Beech等[13]用微阵列技术检测20名抑郁症患者和15名健康人PBMCs的基因表达水平，结果发现其中85个差异表达基因显著富集途径为线粒体能量代谢途径，表明线粒体能量代谢途径在抑郁患者的病理生理过程中发挥重要作用。Pan等[14]采用转录组学技术研究产后抑郁症患者PBMCs基因表达情况，结果显示产后抑郁与参与能量代谢、神经退行性疾病和免疫应答的多种基因表达呈正相关。另有文献报道[10]，在抗抑郁治疗过程中抑郁患者PBMCs中的端粒酶活性增加与抑郁症状减少密切相关。阿戈美拉汀的长期给药降低抑郁模型大鼠PBMCs中色氨酸分解代谢途径上的mRNA表达，进一步调控蛋白表达起到抗抑郁作用[15]。也有研究发现调节Toll受体4信号的microRNA（let-7e、miR-146a和miR-155）在抑郁患者中表达降低，并且这些microRNA表达水平通过抗抑郁治疗后得到回调[16]。抑郁症的严重程度与PBMCs中2′,5′-寡腺苷酸合成酶、Toll受体及P2X7受体的含量呈正相关，与β-抑制蛋白1的含量呈负相关[17-20]。PBMCs可通过血脑屏障进入中枢，参与脑内的病理生理过程[21-22]。同时，PBMCs表达抑郁症相关的基因与脑具有一定相似性[23-24]。He等[25]对重度抑郁患者PBMCs的miRNAs表达水平进行研究，发现能够调控脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、环磷腺苷效应元件结合蛋白1（cAMP-response element binding protein，CREB）表达的miR-124表达水平明显高于健康人，给予抗抑郁药后miR-124水平得到回调，提示大脑中丰富表达的miR-124可能作为抑郁症的外周系统的标志物。此外，鉴于脑脊液和脑组织活检样本在临床上不适用于常规筛查或诊断，PBMCs在抑郁症诊断生物标志物筛选中显示出其独特的优势。综上所述，抑郁症发生必然对PBMCs造成影响，以PBMCs为切入点，适用于抑郁症发病机制及抗抑郁药物在基因或蛋白水平的深入研究。
转录组学是在整体水平上研究细胞中所有基因转录及转录调控规律的学科，有助于了解疾病发生发展过程中基因的表达情况，进而从转录水平揭示生命过程的代谢网络及调控机制[26]。本研究借助转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）技术从基因水平进行研究，探寻正常、抑郁以及柴归颗粒干预后PBMCs中的差异表达基因，并对测序结果进行生物信息学分析及验证，以期阐明柴归颗粒改善抑郁症可能的靶基因及相关通路，进而阐明柴归颗粒抗抑郁的作用机制。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠，6～7周龄，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0006。实验期间动物保持自由饮水和进食，饲养环境温度为（24±1）℃，湿度为（55±5）%，12 h明暗交替光照，实验前适应性饲养1周。动物实验获得山西大学伦理委员会的批准（批准号SXULL-2020028）。
1.2 药材
柴归颗粒（10 g/袋，批号20181009）由山西省中医研究院制剂中心制备，所用中药材有柴胡、当归、白芍、麸炒白术、炙甘草和薄荷，以上药材均购自山西省华阳药业有限公司，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定分别为柴胡DC.、当归(Oliv.) Diels.、白芍Pall.、白术Koidz.、甘草Fisch.和薄荷Briq.，均符合《中国药典》2020年版标准。本课题组前期通过研究建立了柴归颗粒的指纹图谱并通过对照品指认出12种化学成分，分别为芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸铵、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、白术内酯III、欧前胡素、藁本内酯、白术内酯I和白术内酯II。经高效液相色谱含量测定方法测得柴胡皂苷a、b2、b1、d的总质量分数为0.68%，芍药苷的质量分数为0.98%以上，将柴胡皂苷a、b2、b1、d和芍药苷作为柴归颗粒的质控标准[27-28]。
1.3 药品与试剂
盐酸文拉法辛缓释胶囊（75 mg/粒，进口药品注册证号H20160382H20160383，分包装批准文号国药准字J20160087，批号CF1090D）购自Pfizer Ireland Pharmaceuticals公司；Oligo（dT）18Primer（批号AL11594A）、dNTP Mixture（批号AJG1229A）、RNase Inhibitor（批号AK32360A）、2×TaqPCR Master Mix（批号U9202）、SYBR®Green Realtime PCR Master Mix（批号067600）、Trizol试剂购自日本Takara公司；DEPC处理水购自北京索莱宝生物科技有限公司；分析级氯仿、异丙醇和无水乙醇。
1.4 仪器
恒温鼓风干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）；大鼠旷场测试箱（长100 cm、宽100 cm、高70 cm，黑色，25格，实验室自制）；KQ-400KDE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-5型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BSA124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；NC2000 Nanodrop紫外定量仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent Technologies生物分析仪2100系统（美国CA公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；BG-gdsAUTO（130）凝胶成像系统（北京百晶生物技术有限公司）；2720型PCR扩增仪（美国ABI公司）；FLX800T型酶标仪（美国Bio Tek公司）。
2 方法
2.1 柴归颗粒的制备
柴胡、当归、白芍、麸炒白术、炙甘草和薄荷6味药材用8倍量85%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，药液浓缩、干燥至浸膏；药渣用8倍量水提2次，每次2 h，将水提液浓缩至1.10 g/mL（65 ℃），乙醇沉淀浓度为50%，静置48 h，滤过，回收乙醇，浓缩、干燥至浸膏；混合乙醇提取物和水提醇沉物，即得复方柴归方提取物。淀粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉均为辅料，采用干法制粒技术，取干浸膏粉，成品采用聚酯/镀铝聚酯/聚乙烯药用复合膜包装，即得到柴归颗粒。此工艺由山西省中医研究院制剂中心制备，10 g/袋，每袋含生药量27.5 g。
2.2 分组与给药
经体质量、旷场实验、糖水偏爱实验测试后，选择指标相近的大鼠60只，随机分为对照组、模型组、盐酸文拉法辛（35 mg/kg）组和柴归颗粒低、中、高剂量（4.2、8.3、16.6 g/kg）组，每组10只，大鼠造模同时给药，各给药组ig相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续28 d。
2.3 慢性不可预知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁模型的建立
参照本课题组前期方法[29]，建立CUMS大鼠抑郁模型。对照组大鼠正常饲养，不接受任何刺激。其余各组接受28 d造模程序，主要包括热刺激、4 ℃冰水游泳、超声刺激、夹尾、昼夜颠倒、足底电击、禁水（24 h）束缚和禁食（24 h）等。每组动物每天随机给予1种刺激，同一种刺激累计使用不超过4次。
2.4 行为学检测
参照本课题组前期行为学检测方法[29]，进行行为学实验，包括体质量实验、糖水偏爱实验、旷场实验和强迫游泳实验。
2.4.1 体质量实验 在实验第0、7、14、21和28天分别称定大鼠体质量。
2.4.2 糖水偏爱实验 在实验之前，需要进行糖水偏爱训练。准备1%蔗糖溶液和日常饮用水用于训练和实验。每只大鼠（单笼饲养）饲养笼上放置2个水瓶，训练开始第1天给予2瓶1%蔗糖溶液，第2天将其中1瓶1%蔗糖水溶液换为日常饮用水。训练结束后，所有大鼠禁食禁水24 h，然后在12 h内正式进行糖水偏爱实验测定糖水消耗量，实验期间大鼠自由选择饮用1%蔗糖水溶液或水。第0天测定糖水偏爱率的基线，第28天进行糖水偏爱实验，计算每只大鼠的糖水偏爱率。
糖水偏爱率＝消耗的蔗糖水溶液的质量/(消耗的蔗糖水溶液的质量＋消耗日常饮用水的质量)
2.4.3 旷场实验 实验第0、7、14、21、28天，旷场实验装置的底部（100 cm×100 cm×40 cm）被等分成25个正方形，在相对安静的环境里（≤60分贝）从16: 00～19: 00时进行旷场实验测试。将大鼠置于旷场实验装置中1 min以适应环境，观察大鼠穿越格数（至少3只爪子跨过网格线）和直立次数（两前肢距离地面至少1 cm）。适应环境1 min后，记录4 min内的大鼠的穿越格数和直立次数。
2.4.4 强迫游泳实验 强迫游泳实验装置为高50 cm、直径20 cm的圆柱形有机玻璃容器，水温（25±1）℃，水深30 cm。实验第28天，每只大鼠接受15 min的强迫游泳训练，并在第29天进行强迫游泳实验。每只大鼠进行强迫游泳实验6 min，在最后4 min记录不动时间。大鼠保持头部悬浮在水面上并且无明显挣扎的时间为不动时间。
2.5 PBMCs样本收集
末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h，大鼠ip 10%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，用肝素钠抗凝管收集血液约10 mL。取血1 h内，取15 mL的离心管，先加入聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll-Hypaque）5 mL，按照全血量与分离液比例为1∶1，再沿壁缓慢加入抗凝血，室温2000 r/min离心25 min，吸取血浆至离心管，再取离心管吸取PBMCs，加入适量清洗液，1000 r/min离心10 min，弃上清，清洗2次。根据行为学测试结果可以看出柴归颗粒中剂量组的抗抑郁效果较好，更接近对照组，因此选用对照组、模型组和柴归颗粒中剂量组大鼠PBMCs样本进行后续的RNA-seq实验。在对照组、模型组和柴归颗粒中剂量组中每组选取4个PBMC样本进行RNA-seq前样本准备，加入适量PBS溶液清洗细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，清洗2次；加入适量Trizol试剂提取总RNA，反复吹打至PBMCs充分裂解，将裂解液转移至1.5 mL无酶管中液氮速冻，于−80 ℃保存。
2.6 RNA-seq分析
利用RNA 6000Nanokit检测仪检测所提RNA的浓度和纯度，质检合格后，通过Oligo（dT）磁珠富集总RNA中带有polyA结构的mRNA，采用离子打断的方式，将RNA打断到200～300 bp片段。随后合成cDNA第一链，并以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，建立链特异性文库。使用安捷伦2100生物分析仪对文库进行质检，采用第二代测序技术，基于Illumina HiSeq测序平台，对文库进行双末端测序，得到FASTQ格式的原始数据（raw data）。使用Cutadapt软件对原始数据进行过滤，使用TopHat2软件将过滤后得到的高质量序列（cleaned data）的Reads比对到参考基因组上。
2.7 RNA-seq数据分析
使用HTSeq统计每组样本比对到每个基因上的Reads数，作为基因的原始表达量，然后采用FPKM对表达量进行标准化。采用DESeq对基因表达进行差异分析，筛选差异表达基因条件：表达差异倍数＞1.2、＜0.05。采用R语言ggplots2软件包绘制差异表达基因的火山图，使用Venn图统计差异基因个数以及各组差异分析之间的共有基因数量。为进一步筛选显著变化的基因群，采用STEM软件将差异基因进行趋势分析。将差异基因注释到京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库中，进而确定差异表达基因主要参与的代谢途径和信号通路。
2.8 qRT-PCR验证
各组选取6只大鼠，使用Trizol试剂提取PBMCs中的总RNA。选取转录组数据中有趋势表达的差异基因进行qRT-PCR验证，作为内参基因，采用2−ΔΔCt计算差异表达基因的mRNA相对表达量。胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3，）、单磷酸腺苷脱氨酶1（adenosine monophosphate deaminase 1，）、单磷酸鸟苷还原酶2（guanosine monophosphate reductase 2，）、胞质-5′-核苷酸酶IIIA（5′-nucleotidase, cytosolic IIIA，）、腺苷酸脱氨酶（adenosine deaminase，）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，）、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，）、鸟嘌呤脱氨酶（guanine deaminase，）、嘌呤能受体P2X7（purinergic receptor P2X7，）、白细胞介素1β（interleukin 1β，）引物采用Primer Primer 5软件设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成，各引物序列见表1。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
基因名基因号（ID）序列 (5’-3’)产物大小/bp Enpp3ENSRNOG00000013791F: CCATTGTCACGGGTTTGTAT121 R: CTCCACCAGGCAGGGTTA Ampd1ENSRNOG00000018656F: CAAGCCCTACCCTTACCCA 175 R: CTTCAGCTCCTTTAGCTCGTC Gmpr2ENSRNOG00000020216F: ATGGCAGGCAATGTGGTAA297 R: CCGTCTGAAATGATGTGGC Nt5c3aENSRNOG00000005981F: AGGATGGCCGATGGTGTA136 R: CAACCTCCAGTGATTCTTCTTT AdaENSRNOG00000010265F: GGGACTACGCAACATTATCG149 R: CTTCCTTTGCCTTCATCTCC PnpENSRNOG00000009982F: ACATCGACCTCAAGTGGCA106 R: GGGAAAGTTGGGTATCTCATT XdhENSRNOG00000007081F: TTTGCGAAGGATGAGGTTAC133 R: GGATTGTGATAATGGCTGGA GdaENSRNOG00000018282F: CCCTCAGTATGCCTTTGCT158 R: TGGTGGTGCCGTTCTTTA P2rX7ENSRNOG00000001296F: GTGCCATTCTGACCAGGGTTGTATAAA354 R: GCCACCTCTGTAAAGTTCTCTCCGATT IL1βENSRNOG00000004649F: TTGCTTCCAAGCCCTTGACT214 R: CTCCACGGGCAAGACATAGG ATCBENSRNOG00000034254F: GAGACCTTCAACACCCCAGC205 R: ATGTCACGCACGATTTCCC
2.9 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.01软件进行统计分析，数据以表示，多组间使用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett-检验。
3 结果
3.1 行为学检测
3.1.1 体质量实验 如图1-A所示，第0天，各组大鼠体质量无差异，体质量基线基本不变。如图1-B所示，第28天，与对照组相比，模型组大鼠体质量显著减轻（＜0.001）；与模型组比较，柴归颗粒中剂量组大鼠体质量明显增加（＜0.05），表明柴归颗粒能够有效逆转CUMS造模引起的大鼠体质量减轻。
3.1.2 旷场实验 如图2所示，与对照组相比，模型组大鼠穿越格数和直立次数显著减少（＜0.001），表明CUMS模型成功复制。与模型组比较，各给药组大鼠穿越格数显著增加（＜0.01、0.001），柴归颗粒中剂量组大鼠直立次数显著增加（＜0.05）。表明柴归颗粒能够有效改善CUMS抑郁大鼠的旷场活动情况，且柴归颗粒中剂量组效果最佳。
C-对照组 M-模型组 P-盐酸文拉法辛组 CG-L-柴归颗粒低剂量组 CG-M-柴归颗粒中剂量组 CG-H-柴归颗粒高剂量组 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，图2、3、7同
图2 柴归颗粒对抑郁大鼠旷场实验中穿越格数和直立次数的影响(, n = 10)
3.1.3 糖水偏爱和强迫游泳实验 如图3所示，与对照组相比，模型组大鼠糖水偏爱率显著降低（＜0.001），强迫游泳不动时间显著增加（＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠糖水偏爱率显著升高（＜0.05、0.01、0.001），柴归颗粒各剂量组大鼠强迫游泳不动时间显著减少（＜0.05、0.01）。表明柴归颗粒能够显著逆转抑郁大鼠的快感缺失和行为绝望现象，具有显著的抗抑郁的作用。
3.2 RNA-seq分析
3.2.1 测序数据质量评估 所建立的测序文库中，12个样品的原始数据为4.4×107～5.5×107，每个cDNA文库平均获得4.9×107个原始数据，其中12个样品的Reads差异较小，质量值≥20的碱基所占百分比（20）≥98.09%，质量值≥30的碱基所占百分比（30）≥95.06%，表明测序结果较好，可用于后续的分析（表2）。
图3 柴归颗粒对抑郁大鼠糖水偏爱率和强迫游泳不动时间的影响(, n = 10)
3.2.2 差异表达基因分析 采用DESeq对基因表达进行差异分析，如图4所示，与对照组相比，模型组共有256个显著差异表达基因，其中显著上调的差异基因为105个，显著下调的差异基因为151个；与模型组相比，柴归颗粒中剂量组共有2702个显著差异表达基因，其中显著上调的差异基因为1343个，显著下调的差异基因为1359个。
3.2.3 差异表达基因的KEGG通路分析 将筛选出的差异表达基因进行KEGG通路富集分析，如图5所示，与对照组相比，模型组差异表达基因显著富集到的信号通路主要有B细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、Janus激酶-信号转导与转录活化因子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信号通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信号通路等，研究报道这些信号通路与抑郁症的发病机制密切相关[30-32]。差异表达基因显著富集到的代谢通路主要有糖胺聚糖生物合成和嘌呤代谢等。
如图6所示，与模型组相比，柴归颗粒中剂量组差异表达基因显著富集到的信号通路主要有Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信号通路、Notch信号通路、C型凝集素受体信号通路和p53信号通路等。差异表达基因显著富集到的代谢通路主要有氧化磷酸化、丙酮酸代谢和嘌呤代谢等。
由上述结果可知抑郁发生时及柴归颗粒干预后都显著富集到嘌呤代谢通路。同时，基于目前调控嘌呤代谢抗抑郁的作用机制研究主要集中在嘌呤分解代谢，因此对测序结果进一步挖掘，对嘌呤分解代谢和嘌呤能系统相关的差异表达基因进行统计分析，结果见表3。柴归颗粒干预后，在核苷酸水平上的和基因表达水平显著降低；在核苷水平上的和基因表达水平显著升高；在碱基水平上的基因表达水平显著升高，和基因表达水平有升高趋势；嘌呤能系统中的基因表达水平显著降低，基因表达水平有降低趋势。
表2 每个样本cDNA文库的测序数据
Table 2 Sequencing data of cDNA library in each sample
样本原始条目原始数据Q30数据过滤条目测序错误率/%Q20/%Q30/% C155 056 7368 258 510 4007 851 013 2427 648 513 8000.001 32798.0995.06 C251 320 6487 698 097 2007 359 697 5137 093 751 7000.001 27398.3595.60 C354 235 1188 135 267 7007 768 675 0317 518 813 0000.001 35298.2595.49 C444 196 6146 629 492 1006 331 351 4906 208 298 1000.000 20698.2395.50 M151 243 9907 686 598 5007 353 804 3787 081 146 9000.000 22198.3195.67 M244 989 9266 748 488 9006 431 558 8276 264 447 0000.000 22098.1495.30 M355 924 1988 388 629 7007 862 156 4449 702 595 2000.001 27598.1695.74 M453 359 2588 003 888 7007 615 014 5867 434 598 2000.000 22398.1095.14 CG-M144 703 7146 705 557 1006 423 214 3756 194 225 7000.001 27598.4095.78 CG-M253 714 5968 057 189 4007 747 965 7677 427 522 7000.001 27298.5296.16 CG-M344 819 5286 722 929 2006 426 146 3226 217 330 2000.000 22298.3095.58 CG-M453 934 1668 090 124 9007 702 809 7747 504 610 7000.001 28098.1695.21
C-对照组 M-模型组 P-盐酸文拉法辛组 CG-M-柴归颗粒中剂量组
C-control group M-model group P-venlafaxine hydrochloride group CG-M-Chaigui Granules medium-dose group
红色：上调基因；蓝色：下调基因；灰色：无显著性差异基因
图5 CUMS造模后差异基因的KEGG通路富集分析
图6 柴归颗粒干预后差异基因的KEGG通路富集分析
3.3 嘌呤代谢分解途径关键基因的qRT-PCR验证
以为内参，采用qRT-PCR法对RNA-seq结果中嘌呤分解代谢途径上的8个关键基因、、、、、、、以及嘌呤能通路上2个基因、进行mRNA表达水平的验证。结果如图7所示，与对照组相比，模型组、、、、mRNA表达水平显著下调（＜0.01、0.001）；、、、mRNA表达水平显著上调（＜0.05）。与模型组相比，柴归颗粒中剂量组、、、mRNA表达水平显著升高（＜0.05、0.01、0.001），、、、mRNA表达水平显著降低（＜0.05、0.01）。
表3 柴归颗粒干预抑郁大鼠嘌呤代谢途径关键基因的表达
Table 3 Chaigui Granules interfere with key genes expression in purine metabolism pathway in depressed rats
基因号（ID）基因P值倍数变化（vs模型）趋势（vs模型） ENSRNOG00000018656Ampd10.013 567 5270↓ ENSRNOG00000013791Enpp30.227 797 8501.556 860 409↑ ENSRNOG00000005981Nt5c3a3.63×10−62.559 357 634↑ ENSRNOG00000009982Pnp0.228 367 9821.277 001 431↑ ENSRNOG00000018282Gda0.044 530 0182.159 190 490↑ ENSRNOG00000007081Xdh0.143 547 7981.326 008 513↑ ENSRNOG00000010265Ada0.054 164 4231.468 402 782↑ ENSRNOG00000020216Gmpr20.000 785 0940.484 805 139↓ ENSRNOG00000001296P2rx70.393 944 7650.322 012 382↓ ENSRNOG00000004649IL1β0.009 203 8170.329 862 979↓
↑：上调；↓：下调
↑: up-regulated; ↓: down-regulated
图7 qRT-PCR检测Ada、Ampd1、Enpp3、Nt5c3a、Pnp、Gda、Gmpr2、Xdh、P2rX7和IL1β mRNA表达(, n = 6)
4 讨论
CUMS是目前较为公认的抑郁症动物模型，联合孤养的动物模型[33]能够稳定地模拟人类抑郁症患者的核心症状，即快感缺失，且具有高度的有效性，基于此模型研究抑郁症的病因学和抗抑郁药的作用有重要的科学意义。本研究采用CUMS联合孤养的抑郁模型，通过各种行为学指标（体质量、旷场实验、糖水实验和强迫游泳实验）对柴归颗粒进行药效学评价，同时通过转录组学技术对大鼠PBMCs样本进行转录水平分析，采用RNA-seq高通量测序技术对对照组、模型组和柴归颗粒中剂量组的PBMCs样本进行分析，结果表明，与对照组相比，模型组共筛选出256个差异表达基因；与模型组相比，柴归颗粒中剂量组共筛选出2702个差异表达基因。KEGG通路富集显示抑郁发生时及柴归干预后都显著富集到嘌呤代谢。然后利用qRT-PCR验证嘌呤代谢过程中的8个关键基因、、、、、、、以及嘌呤能通路上的2个基因、的表达，验证结果与RNA-seq结果基本一致。以上结果表明柴归颗粒具有抗抑郁作用，其作用机制与调节嘌呤代谢途径上的基因及嘌呤能受体和炎症因子有关，该结果为后续柴归颗粒抗抑郁作用机制的深入阐明提供了基础。
多条证据显示，抑郁发生时嘌呤代谢途径中的代谢物发生明显变化[34-37]。多种酶参与嘌呤代谢过程且在该过程中发挥着重要作用。其中，Nt5c3a和Pnp是嘌呤代谢核苷酸分解代谢过程重要的酶。Pnp和5′-核苷酸酶在正常T淋巴细胞和B淋巴细胞的分化中起着重要作用[38]。Pnp的缺乏会使T细胞和B细胞免疫力受到影响，还会导致三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）升高从而抑制核糖核苷酸还原酶，阻碍细胞分裂[39]。研究表明细胞内Nt5c3a是干扰素和细胞因子信号传导中的负表观遗传因子[40]。本研究发现CUMS抑郁大鼠PBMCs中和的表达降低，柴归颗粒干预后这2种基因的表达显著回调，提示其可能产生细胞因子信号的传导并影响免疫细胞分裂和分化，与抑郁症的发生关系密切。
Ada是嘌呤代谢中的一种关键酶，它通过将腺苷不可逆转的脱氨为肌苷来调节细胞外和细胞内腺苷的浓度[41-42]。Ada通过催化腺苷和脱氧腺苷的脱氨基作用影响甲基化过程、细胞生长和分化、细胞凋亡、DNA复制和免疫功能[43]。文献报道Ada的主要功能是发展和维持免疫系统，在免疫细胞功能紊乱的疾病中，Ada的活性发生了变化[44]。淋巴细胞的增殖和分化也需要Ada[45-46]。Elgün等[47]发现在重度抑郁症患者血清中Ada水平下降，Ada水平与抑郁症症状存在负相关。也有研究表明Ada的活性降低导致腺苷浓度增加对于诱发抑郁症是一个危险信号，外源性Ada加速腺苷的降解，能缩短小鼠自发电皮质活动的抑郁症持续时间[48]。本研究发现CUMS抑郁大鼠PBMCs中的表达显著降低，与上述文献报道一致，提示与对照组相比，CUMS抑郁大鼠的免疫系统出现紊乱，给予柴归颗粒后的表达水平显著升高。提示柴归颗粒可能通过回调的表达，从而介导细胞免疫功能恢复正常发挥抗抑郁作用。
Xdh位于所有有核细胞中，催化次黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸，这是嘌呤核苷酸分解代谢的另一种关键酶。本研究发现CUMS抑郁大鼠PBMCs中的表达显著升高。Herken等[49]发现抑郁症患者血清中Xdh水平显著升高。在反复抑郁发作患者死后的脑组织中，在皮质边缘丘脑纹状体区域检测到Xdh活性增加[50]。Xdh催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化过程会产生活性氧和过氧化氢等[51]，从而导致以氧化应激和炎症为特征的病理反应[52-53]。一项在人类和小鼠巨噬细胞中进行的研究表明，Xdh引起的活性氧生成是促进Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）活化的主要来源[54]。抑郁症的发病机制与氧化应激相关酶活性的变化和炎症反应密切相关。Gürbüz等[55]使用Xdh抑制剂阿洛普利诺与经典抗抑郁药氟西汀作比较，发现使用Xdh抑制剂阿洛普利诺后抑郁大鼠的强迫游泳不动时间明显减少，与氟西汀的抗抑郁效果一致。本研究结果显示，给予柴归颗粒后，的表达水平显著降低，柴归颗粒有改善抑郁症的作用。综上推断，抑郁发生时Xdh水平升高引起活性氧的生成，可能进一步促进NLRP3活化，调控下游信号通路，从而导致氧化应激和炎症为特征的病理状态。而柴归颗粒是否通过这一作用机制发挥抗抑郁需要进一步研究验证。
此外，目前已经发现嘌呤能系统在抑郁症发病机制中占有重要地位，通过调控嘌呤能系统可有效改善抑郁症[56-59]。嘌呤能受体（腺苷P1受体中A1、A2A亚型与ATP结合的P2受体中P2X7亚型）与抑郁症诱发神经炎症紧密相关[60-62]。研究显示P2rX7主要位于兴奋性细胞膜、神经元和平滑肌中，也存在于粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞和单核细胞中[63]。随着抑郁发病机制的不断研究，已证明抑郁症机体中嘌呤能P2X7受体是一种成熟的炎症小体激活剂，不仅可以激活NLRP3炎症小体，还会促进炎症因子的释放，P2X7受体已被公认为炎症反应的调节因子[64-66]。本研究发现抑郁大鼠PBMCs中和的表达水平显著升高，给予柴归颗粒后，它们的表达水平显著降低。提示抑郁症的发生与炎症反应密切相关，柴归颗粒能够调控，减少炎症因子的释放，从而发挥抗抑郁作用。但还需要进一步验证该通路蛋白的表达情况，明确柴归颗粒抗抑郁的作用机制。
综上所述，柴归颗粒对抑郁大鼠有明显的改善作用，其作用机制与调节嘌呤代谢途径上的基因及嘌呤能受体和炎症因子有关，为后续柴归颗粒抗抑郁作用机制的深入研究提供了基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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Antidepressant mechanism of Chaigui Granules based on transcriptomics of peripheral blood mononuclear cells
WANG Li-wen1, 2, 3, HUANG De-hua1, 2, 3, TIAN Jun-sheng1, 2, 3, GAO Xiao-xia1, 2, 3, QIN Xue-mei1, 2, 3, DU Guan-hua1, 4, ZHOU Yu-zhi1, 2, 3
1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 2. The Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 3. The Key Laboratory of Effective Substances Research and Utilization in TCM of Shanxi Province, Taiyuan 030006, China 4. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
To analyze the transcriptomic characteristics of Chaigui Granules (柴归颗粒) on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of rats with chronic unpredictable mild stress (CUMS) model by RNA sequencing (RNA-seq), qRT-PCR was used to verify the mechanism.Rats were randomly divided into control group, model group, venlafaxine hydrochloride (35 mg/kg)group, and Chaigui Granules low-, medium- and high-dose (4.2, 8.3, 16.6 g/kg)groups. Rats were given drugs for 28 d while modeling. The efficacy of Chaigui Granules was evaluated through traditional pharmacodynamic indicators for depression (body weight, open field test, sugar water preference test and forced swimming test). RNA-seq technology was used to perform transcriptome sequencing analysis on rat PBMCs, screen for differential genes, and perform Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis; The key expressed genes screened out were verified experimentally by qRT-PCR.Behavioral indicators showed that Chaigui Granules significantly improved the depressive behavior of CUMS model rats. Enrichment analysis of KEGG pathway in transcriptomics showed that when depression occurs after the intervention of Chaigui Granules, purine metabolism pathway was significantly enriched. Therefore, in-depth research was conducted on gene expression of metabolic enzymes related to purine metabolism. qRT-PCR results showed that compared with model group, expression levels of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3 (), cytosolic-5′-nucleotidase IIIA(), purine nucleoside phosphorylase() and adenosine deaminase() mRNA in PBMCs of Chaigui Granules group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), expression levels of xanthine dehydrogenase/oxidase(), purinergic receptor P2X7 (), interleukin 1β ()mRNA were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Chaigui Granules has antidepressant effects, its mechanism is related to the regulation of genes in purine metabolism pathway, purinergic receptorand inflammatory factor.
Chaigui Granules; chronic unpredictable mild stress depression; peripheral blood mononuclear cells; transcriptomics; purine metabolism
R285.5
A
0253 - 2670(2022)07 - 2031 - 13
10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.012
2021-12-02
国家自然科学基金资助项目（82074323）；国家自然科学基金资助项目（81673572）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2017ZX09301047）；山西省留学回国人员科技活动择优资助项目（201991）；山西省回国留学人员科研资助项目（2020019）
王力文，男，硕士研究生，研究方向为中药药理作用机制研究。E-mail: 18434375989@163.com
周玉枝，女，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药药效物质基础及作用机制研究。E-mail: zhouyuzhi@sxu.edu.cn
[责任编辑 李亚楠]
