基于顶空气相离子迁移谱的干腐病马铃薯挥发性成分分析

张 凡，张宇帆，苏心悦，徐文雅，安焕炯，马倩云，孙剑锋，王 颉，王文秀

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

马铃薯是世界第四大农作物，既可以作为食物，又可以作为高质量淀粉的重要来源[1]。其适应能力强，产量高，种植面积广，是饮食中碳水化合物、维生素和矿物质的良好来源[2]。在贮藏过程中，马铃薯极易受到镰刀菌的侵染而发生干腐病，导致其块茎不断脱水干缩，内部出现空腔、凹陷和腐烂，广泛分布在世界马铃薯主产区并造成严重的经济损失，目前已成为马铃薯贮藏期间的重要病害之一[3]。随着镰刀菌侵染时间的延长，不仅表面和内部组织结构发生变化，还会散发出与正常马铃薯不同的气味。这些挥发性气体物质的产生，与镰刀菌在马铃薯上生长代谢，引起其自身化合物的降解密切相关。近年来，随着智能传感器系统的不断发展，气味信号作为样品的“气味指纹标记”，已在果蔬的病害监控方面发挥了重要的作用[4-5]。辨识干腐病马铃薯的特异性气味，对于实现其早期诊断识别具有重要意义。

马铃薯在贮藏和腐败过程中挥发性气体成分多样，不稳定性强，反应复杂，难以跟踪其变化[6]。目前，气相色谱-质谱联用技术和气相离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技术是分析挥发性化合物中常用的技术手段。其中，顶空GC-IMS（headspace-GC-IMS，HS-GC-IMS）是近几十年发展起来的一种用于检测、识别和监测不同基质中痕量有机化合物的技术[7]，具有灵敏度高、定性分析准确、样品制备简单的特点[8-9]。目前已在酒类[10-11]、果蔬[12-14]、肉类[15-16]等物质的风味成分分析方面有所应用，此外在羊肉掺假[17]、山茶油掺假[18]、化妆品品质鉴定[19]、中药材品种区分及成分鉴定[20-21]等方面也有所研究。然而将HSGC-IMS技术用于干腐病马铃薯特异性挥发性成分分析的研究鲜有报道。

针对上述问题，本研究以健康和不同病害程度的干腐病马铃薯为实验原料，采用HS-GC-IMS技术对其挥发性成分进行检测，同时结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和指纹图谱技术进行统计分析，全面比较不同腐败程度马铃薯样品中挥发性成分之间的差异，辩识干腐病马铃薯特异性挥发性成分，为基于气味指纹图谱信息的干腐病马铃薯的诊断识别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大西洋马铃薯，由河北省张家口市弘基农业科技开发责任有限公司提供。

95%乙醇、85%磷酸、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白 国药集团化学试剂有限公司；淀粉试剂盒、丙二醛试剂盒 上海优选生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AR423CN电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司；HH-4水浴锅 上海比朗仪器有限公司；20 mL顶空进样瓶 上海安谱实验科技股份有限公司；FlavourSpec®风味分析仪 山东海能科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备与处理

以张家口地区干腐病马铃薯为对象，经组织分离及单孢纯化后获得接骨木镰刀菌菌种，并将其在无菌环境下配制成浓度为106CFU/mL孢子菌悬液备用。

挑选表皮无任何明显病害、外观整齐、大小一致、表面光滑的马铃薯进行菌悬液的接种。在进行实验前，将马铃薯清洗干净，再用75%的乙醇溶液擦拭表面，最后用蒸馏水冲洗，置于室温下自然晾干备用。在健康马铃薯表皮上制作3 个小孔，随之将10 μL镰刀菌的孢子菌悬液注射入孔内进行真菌侵染，从而产生马铃薯干腐病。为保证马铃薯干腐病发生，将制作的样品放置到人工气候箱中贮藏，其环境始终保持为24～25 ℃，相对湿度为90%。为获取不同腐败程度马铃薯样品，每隔7 d对3 个样品进行接种，并置于人工气候箱中培养，至第21天时不接种，此时可获得健康、轻度腐败、中度腐败和重度腐败的马铃薯样品用于HS-GC-IMS分析，每个样品进行3 次平行实验。健康、轻度腐败、中度腐败、重度腐败的样品分别表示为Jian-n、Qing-n、Medium-n、Zhong-n，n为样品标号。

1.3.2 顶空进样条件

称取待测样品5 g置于20 mL顶空进样瓶中，封口。90 ℃孵育30 min后进样，进样针温度为85 ℃，进样体积为100 μL。

1.3.3 GC-IMS条件

MXT-5色谱柱（15 m×0.53 mm，4 μm）；孵化转速500 r/min，柱温60 ℃，所用载气为N2，IMS温度45 ℃，运行分析时间20 min。载气流量梯度设置：初始流速2 mL/min，保持2 min；2～10 min内线性升至10 mL/min；10～20 min内线性升至100 mL/min后停止。

1.3.4 理化指标的测定

可溶性蛋白质：采用考马斯亮蓝G-250染色法[22]进行测定。

丙二醛含量测定：参照丙二醛含量检测试剂盒进行测定，其中丙二醛含量按式（1）计算：

式中：V1为反应体系总体积（8×10－4L）；V2为加入样品体积（0.2 mL）；V3为加入提取液体积（1 mL）；ε为丙二醛摩尔吸光系数（155×103L/（mol•cm））；d为比色皿光径（1 cm）；W为样品质量/g，ΔA为A532－A600（吸光度）。

淀粉含量测定：参照淀粉含量检测试剂盒法测定，按式（2）计算淀粉含量：

式中：C为稀释倍数（25）；x为标准曲线求得的淀粉质量浓度/（mg/mL）；V为提取后体积（1.7 mL）；W为样品鲜质量/g。

对于以上指标，每个样品重复测定3 次，最后求其平均值。

1.4 数据处理

应用FlavourSpec®风味分析仪内置的NIST数据库和IMS数据库对挥发性气体物质进行定性分析；利用软件的配置Reporter插件对比样品之间的谱图差异（二维俯视图和差异谱图）；利用Gallery Plot插件进行指纹图谱对比，用于比较不同样品之间的挥发性气体物质差异；采用Dynamic PCA插件进行样品聚类分析；利用Origin2019b对不同腐败程度样品的化学成分变化进行分析与作图。

2 结果与分析

2.1 不同腐败程度样品化学成分变化分析

在接骨木镰刀菌侵染马铃薯的过程中，其含有的丙二醛、可溶性蛋白及淀粉含量会发生显著变化。在植物处于衰老、干旱或腐败等逆境时，组织或器官膜脂质发生过氧化反应产生丙二醛[23]，其含量与氧化程度呈正比。由图1a可知，随着腐败程度的加深，丙二醛含量逐渐增大，表明接骨木镰刀菌的侵入造成了细胞膜系统的破坏，从而导致膜氧化，最终产生了较多的丙二醛。可溶性蛋白质是食用马铃薯营养品质的重要组成成分[24]，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用。由图1b可知，接骨木镰刀菌的侵染诱导了马铃薯块茎中可溶性蛋白含量的增加。在侵染初期（健康～轻度），可溶性蛋白质含量升高的幅度较大，这个时期马铃薯块茎中的可溶性蛋白快速积累可能与马铃薯对接骨木镰刀菌产生应激反应，使块茎内各种防御酶被激活有关[25]。如图1c所示，随着腐败程度的增大，淀粉含量急剧下降，可能是由于接骨木镰刀菌侵染马铃薯过程中，为了自身生长繁殖，对马铃薯内的营养物质进行分解和消耗，从而导致淀粉含量的减少。

图1 不同腐败程度马铃薯样品中化学成分含量变化Fig. 1 Changes in chemical components of potato samples with different degrees of dry rot

2.2 不同腐败程度马铃薯GC-IMS分析

采用HS-GC-IMS对不同腐败程度干腐病马铃薯样品中的挥发性气体物质进行测定。将三维GC-IMS谱图投影到二维平面，得到GC-IMS二维俯视图，直接对不同腐败程度马铃薯样品中的挥发性成分进行对比分析。如图2a所示，背景颜色为蓝色，方框最左侧红色竖线代表反应离子峰，在其右侧存在一些点，每一点都代表一种挥发性成分，颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。将某类样品中某物质最大的信号峰定义为100，据此比较其他样品中该物质信号峰的强度，分析每种挥发性成分信号峰的相对强度，从而推断该挥发性成分在不同样品中的相对浓度。由图2可知，大多数信号出现在100～500 s的保持时间和1.0～1.7 ms的漂移时间，4 种不同腐败程度马铃薯样品挥发性成分存在较大差异。

为更加明显比较不同样品间的差异，采用差异对比模式选取其中一个样品的谱图作为参比，其他样品的谱图扣减参比。在参比物和分析物中浓度相同的挥发性成分，背景会呈现白色，蓝色表示化合物的浓度小于参考值，红色表示化合物的浓度大于参考值。本研究以健康样品的谱图为参考，与其他样品的谱图作扣减。如图2b所示，随着腐败程度的加大，红色区域越多，代表与健康样品挥发性成分的浓度差异较大。

图2 不同腐败程度马铃薯GC-IMS二维谱图Fig. 2 Two-dimensional GC-IMS spectra of potato samples with different degrees of dry rot

2.3 不同病害程度马铃薯挥发性成分定性分析

根据离子迁移时间及保留指数对样品挥发性化合物进行定性分析。采用和样品相同的气相条件测试正构酮类（C4～C9）校准液，建立保留指数（已知）和保留时间的校准曲线，对于未知物质，可通过其保留时间计算相应的保留指数。通过GC-IMS库（NIST 2014数据库、IMS迁移时间数据库）进行匹配从而确定挥发性组分的种类。

图3 4种腐败程度样品挥发性成分特征峰位置点Fig. 3 Position points of characteristic peaks of volatile components in potato samples with different degrees of dry rot

表1GC-IMS鉴定不同腐败程度马铃薯的挥发性成分Table 1 Volatile components in potato samples with different degrees of dry rot identified by GC-IMS

续表1

如图3所示，图中数字标明样品挥发性成分特征峰位置点，每个标记点代表定性分析的一种具体挥发性成分。如表1所示，从不同腐败程度马铃薯样品中共检测出43 种挥发性成分，包括醛类18 种、醇类9 种、酮类5 种、烯烃类5 种、酯类2 种、胺类2 种、呋喃类1 种、醚类1 种，其中某些物质包括单体和二聚体。4 类样品中共有的挥发性成分包括以下23 种：丙酮、异丁醛（单聚体）、异丁醛（二聚体）、2-甲基丁醛（单聚体）、2-甲基丁醛（二聚体）、3-甲基丁醛（单聚体）、3-甲基丁醛（二聚体）、2-庚酮、柠檬烯（单聚体）、柠檬烯（二聚体）、戊基呋喃、(E)-2-戊烯醛、正戊醛（单聚体）、正戊醛（二聚体）、2,3-丁二酮、2-丁酮、乙醛（单聚体）、乙醛（二聚体）、庚醛（单聚体）、庚醛（二聚体）、乙酸乙酯、α-水芹烯、(E)-辛烯；其中，健康样品成分还包括：正戊醇（单聚体）、正戊醇（二聚体）、甲硫基丙醛（单聚体）、甲硫基丙醛（二聚体）、3-辛醇、苯甲醛、2-甲基丁醇（单聚体）、2-甲基丁醇（二聚体）、3-甲基丁醇（单聚体）、3-甲基丁醇（二聚体）；轻度腐败样品成分还包括：乙醇、庚醛（二聚体）、环己酮、正戊醇（单聚体）、正戊醇（二聚体）、甲硫基丙醛（单聚体）、甲硫基丙醛（二聚体）、3-辛醇、苯甲醛；中度腐败样品成分还包括：乙醇、庚醛（二聚体）、环己酮、丙胺、正戊醇（单聚体）、正戊醇（二聚体）、甲硫基丙醛（单聚体）、甲硫基丙醛（二聚体）；重度腐败样品成分还包括：二丙基二硫醚、苯乙烯、异丁醇、壬烯醛、乙醇、庚醛（二聚体）、环己酮、丙胺。结果表明马铃薯在腐败过程中辛烯、α-水芹烯、环己酮、庚醛、乙醛含量不断增加，且重度腐败样品中产生了二丙基二硫醚、苯乙烯、异丁醇、壬烯醛成分。

2.4 挥发性成分指纹图谱对比

图4 马铃薯样品的挥发性成分指纹图谱Fig. 4 Fingerprint of volatile components in potato samples

为更好地凸显不同病害程度马铃薯样品挥发性成分的差异，利用LAV软件的GalleryPlot插件选取所有峰进行指纹图谱对比，结果如图4所示。根据指纹图谱可以看出每种样品的完整挥发性成分信息以及样品之间挥发性成分的差异。

由图4可观察到，马铃薯样品腐败程度增大过程中挥发性成分的变化：图中2号区域物质（戊醇、庚酮、3-辛醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、3-甲硫基丙醛和柠檬烯等）显示挥发性成分在马铃薯健康时浓度最高，其可作为健康马铃薯的特征挥发性物质；随着马铃薯干腐病病害程度的增加，图中1号区域物质（丙酮、异丁醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛等）的含量逐渐减小；另外，图中3号区域物质在马铃薯轻度腐败时浓度最高，包括(E)-2-戊醛、2-戊基呋喃、戊醛、2,3-丁二酮和丁酮等；其中4号区域物质（己醛和乙醇等）为中度腐败马铃薯样品的特征挥发性物质。图中5号区域物质（正丙醇、庚醛、环己酮、乙酸乙酯、二丙基二硫、2-甲基-1-丙醇、苯乙烯、α-水芹烯、(E)-2-辛醛和(E)-2-壬醛等）显示挥发性物在马铃薯腐败严重时浓度最高。以上研究结果表明，马铃薯干腐病的腐败程度将直接影响挥发性成分的含量变化，其中辛烯、α-水芹烯、环己酮、庚醛、乙醛含量的增大代表了样品干腐病的腐败程度加深。

2.5 动态PCA

PCA是一种基于多元统计的检测方法，能将高维数组进行维度压缩，从而保留数据大量信息[26]。本研究以特征峰对应的峰强度值为参数变量，利用Dynamic PCA插件对不同腐败程度马铃薯进行PCA，实现不同样品特征差异的可视化，结果如图5所示。前2 个PC的贡献率分别为55%和18%，且样品在分布图上占据了相对独立的空间，可以看出健康样品和中度、重度腐败样品的差异较大，与轻度腐败样品的风味特征相对相似，但大部分也能明显分离。

图5 不同腐败程度样品的PCAFig. 5 PCA plot of potato samples with different degrees of dry rot

3 讨 论

本研究利用HS-GC-IMS技术对健康和不同病害程度（轻度干腐病、中度干腐病、重度干腐病）马铃薯样品中挥发性成分进行检测，发现不同类别样品中含有的物质种类及含量有所差异，不同腐败程度样品中检测出的挥发性成分主要包括醛类、醇类、酮类、烯烃类、酯类、胺类、呋喃类、醚类等。其中醛类物质占有较大比例，其主要由脂类成分降解产生[27]，其次是由美拉德反应过程中氨基酸和糖类反应生成的呋喃及吡嗪类物质组成[28-30]。在接骨木镰刀菌侵染新鲜马铃薯的过程中，随着腐败程度的加深，气体物质的成分发生改变，气体物质的种类增加，主要源于镰刀菌的侵染造成了细胞膜系统的破坏，从而引起膜氧化，导致脂类物质降解产生更多醛类成分，尤其丙二醛的含量急剧增加。另外，淀粉作为马铃薯主要营养成分被消耗、分解成葡萄糖，而葡萄糖作为还原糖与氨基化合物（氨基酸和蛋白质）发生美拉德反应，从而导致更多气体物质的产生。马铃薯中含有的蛋白质对气体物质的吸附作用一定程度上决定着马铃薯风味品质[31-32]。在接骨木镰刀菌侵染马铃薯块茎的过程中，可溶性蛋白质为抵御接骨木镰刀菌的侵染起到了抑制作用，随着干腐病腐败程度的增大，可溶性蛋白含量增加，所含有的辛烯、α-水芹烯、环己酮、庚醛、乙醛含量也增大，此现象主要源于蛋白质对一些挥发性气体物质（酮类和醛类）具有一定促进作用[33]。

4 结 论

本研究以健康和不同腐败程度（轻度干腐病、中度干腐病、重度干腐病）马铃薯样品为研究对象，利用HSGC-IMS技术对样品中挥发性成分进行鉴定分析，通过测定离子漂移时间和离子峰值强度，对各组分进行定性。结果表明，共检测出43 种挥发性成分，主要包括醛类18 种、醇类9 种、酮类5 种、烯烃类5 种、酯类2 种、胺类2 种、呋喃类1 种、醚类1 种。采用指纹图谱对不同腐败程度样品中挥发性成分进行分析，得到每类样品的完整挥发性成分信息以及样品之间挥发性成分的差异。随着干腐病病害程度的加剧，辛烯、α-水芹烯、环己酮、庚醛、乙醛含量逐渐增大，且重度腐败样品中产生二丙基二硫醚、苯乙烯、异丁醇、壬烯醛成分，以上可作为与镰刀菌代谢产物有关的特异性气味成分。本研究利用HS-GC-IMS技术对不同病害程度马铃薯进行鉴别，辩识了干腐病马铃薯特异性挥发性成分，为基于气味传感信息实现马铃薯干腐病的诊断识别提供理论依据。