过敏性紫癜患儿血清microRNA-6769b-5p的表达及与IL-10相关性

李静

(锦州医科大学附属第一医院儿科，辽宁 锦州 121000)

过敏性紫癜(HSP)作为儿童常发病的免疫性疾病之一，对称分布的紫红色紫癜是其重要特征，同时伴有消化道症状和关节症状及肾脏损害。已知HSP发病过程中炎症反应导致免疫复合物在血管壁上沉积，该过程可能激活中性粒细胞并增强炎性细胞因子的产生，从而引起组织损伤[1]。目前为止，HSP的发病发病机制仍然不清。

微小RNA(microRNA)是一类内源性非编码RNA。microRNA通过转录后调控靶基因的表达，发挥多种功能。microRNA在很多疾病中发挥调节作用，特别是在免疫系统中起重要作用[2]。据报道，microRNA的失调与自身免疫性疾病(例如哮喘、特应性皮炎)有关和变应性鼻炎。然而，我们对microRNA在HSP中的作用仍然知之甚少。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGFA)在HSP发病机制中发挥重要作用，并是microRNA-6769b-5p的靶基因[3]。IL-10由辅助型T细胞、活化的B细胞和内皮细胞等分泌，发挥多种生物学活性的炎症因子。在炎症反应过程中，IL-10可抑制单核或巨噬细胞产生 IL-1、IL-6、IL-8等多种炎症介质，从而发挥较强的抗炎作用[4]。因此，在这项研究中，我们旨在介绍HSP患儿microRNA-6769b-5p及其与IL-10水平相关性的研究，以期寻找新型炎性生物标志物，从而在HSP治疗和预防中发挥重要作用。

1 资料和方法

1.1 研究对象

以2018年1月1日至2018年5月22日期间在某医院儿科被诊断为HSP儿童45名为研究对象。纳入标准：(1)符合2013年中华医学会儿科学分会免疫学组修订的HSP诊治循证指南；(2)患有其他肾脏疾病，幽门螺旋杆菌感染、全身性炎症或自身免疫性疾病的患者被排除在外，并除外入组前15 d内接受任何治疗的患儿；(3)选取同期儿保门诊体检的27名健康儿童作为对照组。该研究获得某医院伦理委员会的批准(批准文号：202024)，并获得所有参与者监护人的同意。

1.2 检测方法

1.2.1 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRCR)：使用总RNA提取试剂盒(北京，天根)从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中提取总RNA。RNA被逆转录后通过实时定量荧光定量分析法测定hsa-miR-6769b-5p的水平。正向引物：TGGTGGGTGGGGAGGAGA，反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGTATTC。U6snRNA充当内源性控制。使用2-ΔCt方法计算miR-6769b-5p的水平。

1.2.2 酶联免疫吸附测定(ELISA)：采用ELISA方法，使用人IL-10 ELISA试剂盒测定血清IL-10浓度(武汉中美科技有限公司)。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析(GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥)。定量资料使用均数±标准差表示，两组之间比较使用t检验。定性资料以百分比(%)表示，使用χ2检验进行组间比较。Spearman相关分析用于确定miR-6769b-5p与IL-10之间的相关性。曲线下面积(AUC)值根据ROC曲线确定。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 HSP患儿血清microRNA-6769b-5p的表达

为了分析HSP儿童中的microRNA-6769b-5p的表达水平，进行了实时荧光定量PCR检测。与健康对照相比，microRNA-6769b-5p在HSP组中表达下调(P=<0.05)，见图1。

***P<0.05

2.2 microRNA-6769b-5p在HSP儿童血清中的表达

microRNA-6769b-5p水平在HSP儿童的PBMCS中表达为下调。通过ROC曲线，与健康儿童相比较，microRNA-6769b-5p的水平在HSP儿童中表达具有特异性，AUC为0.883，P<0.001，见图2。以上结果表明，在HSP儿童中，microRNA-6769b-5p 发生改变，并且可能具有将HSP儿童与健康儿童区分开来的潜力。除此之外，我们还分析了HSP儿童中不同临床表现，例如皮疹、腹痛、关节炎和/或关节痛、胃出血、首发或是复发病例数中microRNA-6769b-5p的表达水平。结果提示microRNA-6769b-5p的表达水平与腹痛具有相关性，见表1，更多患儿血清中出现microRNA-6769b-5p的高水平表达(AUC为0.094，P<0.001)，见图3。

2.3 HSP患儿中IL-10对HSP患儿腹痛预测

我们分析IL-10对HSP患儿腹痛没有预测价值，AUC为0.504，P>0.001，见图4。

2.4 HSP患儿中microRNA-6769b-5p与IL-10的相关性分析

我们分析了HSP患儿中microRNA-6769b-5p与IL-10之间是否具有相关性，见图5，R=0.03,P=0.856，不具有相关性。

表1 HSP患儿临床表现与血清microRNA-6769b-5的表达水平

图2 microRNA-6769b-5p 的表达水平与诊断HSP的相关性

图3 HSP患儿腹痛症状与microRNA-6769b-5p 水平的相关性

图4 HSP患儿中腹痛症状与IL-10水平的相关性

图5 microRNA-6769b-5p表达 和 IL-10水平的相关性

3 讨 论

作为儿科常见的一种以小血管炎为主要病变的疾病之一，HSP的发病机制与机体免疫功能失衡、感染或是接触一些诱发因素有关，约33%的HSP患儿有复发倾向[5-6]。microRNA是一组内源性非编码小片段基因，是调控基因表达不可或缺的因子,其不仅在细胞分化、凋亡及增殖等过程起到重要的调节作用,而且在免疫系统的发育中起着核心作用[7]。免疫系统功能障碍，可以导致microRNA在体内异常表达[8]。研究发现，microRNA在某些疾病中可以用作诊断性生物标志物，例如癌症，心血管疾病和神经系统疾病[9]。迄今为止，microRNA在HSP儿童中的作用机制尚不清楚。VEGFA又称血管通透性因子，作用非常广泛，就如它的名字一样，能够增强血管的通透性，自身还具有改变血管内皮细胞的功能，维持血管内皮完整性，适当调节血管的血流量，并对肥大细胞产生趋化作用[10]。VEGFA是microRNA-6769b-5p的靶基因，microRNA-6769b-5p在肝硬化中高表达[11]，microRNA-6769b-5p/VEGFA 轴之间的相互作用可能在神经母细胞瘤的发展中起重要作用[12]。但在HSP中表达尚不可知。本研究发现microRNA-6769b-5p在HSP患儿中呈现低表达，提示microRNA-6769b-5p参与了血管炎症反应过程，可能形成免疫复合物在血管内壁堆积造成组织损伤，由此推断其可能与HSP的发病机制有关。

我们分析了microRNA-6769b-5p和HSP患儿的临床特征。除了性别和年龄，microRNA-6769b-5p的水平与腹痛有关，表明microRNA-6769b-5p的下调可能与HSP儿童的腹痛有关。腹型过敏性紫癜以消化道症状为首发，主要表现为腹痛，腹痛部位可以波及腹部任何部位，可呈现阵发性脐周绞痛，伴有压痛，反跳痛较少见。腹部症状可以在特征性的紫癜出现以前发生，大部分腹痛出现在皮疹7 d之内。腹痛的程度可类似于任何的急腹症，同时伴有呕吐，50%的患儿出现血便或呕血或仅仅为大便隐血阳性。如果腹部症状出现在皮疹以前，容易误诊为外科急腹症，如急性阑尾炎等。这种症状主要是由于肠系膜血管炎引起粘膜下出血和肠壁水肿。有报道说microRNA-6769b-5p促进了强大的促炎活性的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的增加[13]。因此，我们推测microRNA-6769b-5p在血液中的促炎细胞因子的产生作用可能会导致其与腹痛相关。结果表明，microRNA-6769b-5p抑制物可能成为缓解HSP期间腹痛症状的有效药物，当然，这个假设需要进一步验证。

IL-10对多种免疫细胞发挥着免疫抑制作用，是一种重要的抗炎细胞因子，防止和抑制强大的特异和非特异性免疫反应，及由此引起的组织损伤是其重要的生理意义,同时IL-10有助于诱导免疫耐受，并可加强“清道夫”功能。鉴于IL-10的分子机制和生物学特征,故本实验着力研究IL-10相关性疾病的免疫治疗有重要意义[14]。作为一种炎症疾病，HSP患者中血清和尿液中IL-10水平升高[15]。还有学者研究小鼠输卵管积水模型发现IL-10通过抑制炎症因子IFN-γ和IL-2的表达，降低宿主清除衣原体能力,加重输卵管积水的发病率[16]。另外李云华等[17]研究报道牙周炎组患者龈沟液中IL-10含量显著低于健康对照组，轻度牙周炎组患者龈沟液中IL-10含量低于重度牙周炎患者，且治疗后牙周炎组龈沟液中IL-10含量明显升高。脓毒血症患者血清中IL-10水平呈高表达，加速疾病的进展，因此，在疾病早期检测IL-10，可以作为脓毒血症的早期诊断指标，对于疾病的预后判断也有一定的指导意义[18]。有研究证明，microRNA与IL-10存在密切关系。例如microRNA-19a抑制动脉粥样硬化患者外周B细胞中的IL-10[19]。沉默microRNA-21通过促进产生IL-10的B细胞的分化来改善自身免疫性脑脊髓炎[20]。Micro RNA-98抑制心脏移植术后患者外周B细胞中的IL-10[21]。本研究中HSP患儿中的microRNA-6769b-5p与血清IL-10无相关性。因此，还需要实验进一步证实HSP的发病机制。

综上所述，通过研究microRNA-6769b-5p表达及其与血清IL-10在HSP患儿血清中的相关性，使我们更好的了解microRNA-6769b-5p在HSP中的所发挥的作用。尽管未发现microRNA-6769b-5p与血清IL-10具有相关性，但是microRNA-6769b-5p作为抑炎因子对于HSP的诊断、预后具有一定的临床价值，鉴于HSP在儿童中发病率逐渐增加，我们后续实验将继续研究其他microRNA在HSP患儿中的表达。