肝癌患者血清中LncRNA-ATB的表达

蒋磊，李玉强，李男，赵明洲，李岩，杨微微

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

肝细胞肝癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)最常见的消化系统肿瘤之一，研究数据显示，目前肝癌相关死亡率高居癌症相关性死亡原因第3位[1]。由于肝癌发病隐匿，多数患者发现时已属晚期，因此寻找并明确肝癌发生发展过程中新的治疗靶点对于今后肝癌的诊断及治疗过程中有着重要的意义。随着人类基因组计划的完成，近年越来越多的研究结果证实，长链非编码 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)的异常表达在肝癌的发生发展过程中发挥着重要的调控作用，有望成为肝癌诊断的生物标记以及新的治疗靶点[2]。其中，lncRNA-ATB (long non-coding RNA active by TGF-β)作为新发现的非编码RNA明星分子[3]，得到了越来越多的关注。

肝癌发生发展过程受到细胞内外多种因素的调控，尤其是近年来随着研究的深入以及测序技术的迅猛发展，越来越多的证据表明细胞中长链非编码 RNA的异常表达与肝癌的发展密切相关[4]。因此研究二者之间的作用机制成为肝癌靶向治疗研究的重要课题。Yuan 等[5]的研究发现并证实了 lncRNA-ATB 在肝癌中的表达及在肝癌 EMT 过程中发挥的作用。Tomoko Saito 等[6]证实 lncRNA-ATB 在胃癌组织中的表达以及其表达与侵袭以及预后的关系。Tomohiro 等[7]进一步证实 lncRNA -ATB 在结直肠癌中的表达及功能。这些结果均证实lncRNA-ATB 在多种肿瘤细胞中的表达具有重要的调控功能，因此探讨 lncRNA-ATB 在血清中的表达具有重要的临床意义。

国内外对于 lncRNA-ATB 的研究多集中在肿瘤细胞内部，对于其在肿瘤细胞外微环境中的作用，尤其在血中的作用及机制尚未完全阐释清楚，本研究拟通过分析 lncRNA-ATB 在健康人群血清和肝癌患者术前、术后不同时期血清中的表达差异，明确血清中 lncRNA-ATB 在肝癌发生发展中的作用，并将其作为诊断肝癌的分子生物学标志物，为靶向治疗肝癌提供理论和实验的基础。

1 材料和方法

1.1 临床资料

在本次研究中，我们收集了某医院2015年1月至2018年期间行确诊肝癌患者血清(未进行化疗与放疗治疗者)120例为实验组，本研究中收集的所有病例均有详细且完整的临床病例资料(患者年龄，性别，肿瘤大小，分化程度，转移情况TNM分期)；术前未行放化疗等相关抗肿瘤治疗；组织标本为手术切除后留取，且切缘为阴性；病理确诊为肝细胞癌；所有患者均是首次确诊且未合并其他肿瘤。在本研究中，收集健康体检者(体检科)的正常血清 90例作为对照(排除恶性肿瘤以及其他重要器官功能病变或受损)。所有纳入项目者均已签署知情同意书，同时本项目通过本院及学院伦理委员会的批准。

1.2 血清样本采集及处理

纳入本次研究的静脉血全部经由病房护士留取，收取的所有血液标本均在冰盒中运输，在2 h内离心(4 ℃，3500 rpm，10 min)，经离心后，小心吸取血清成分，分装入 15 mL 无菌离心管中，装入 -80 ℃ 冰箱中保存。按照说明书(QIAGEN)提取血清中的 RNA，RNA 浓度通过 NanoDrop1000 Spectrophotometer 测定，qPCR检测血清中 lncRNA-ATB 的表达。

1.3 QPCR

血清中RNA 提取按说明书进行，本研究中所涉及的引物通过 Primer3 在线网站设计，real-time PCR 反应条件为 95 ℃ 30 s，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，42个循环后通过读取实验组与对照组中的 Ct 值，按2-△△Ct计算患者及健康者血清中 lncRNA 的相对表达量。

1.4 统计学方法

本研究中所涉及的数据通过 SPSS 17.0软件进行处理，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较通过应用独立样本t检验，计数资料通过卡方检验比较差异，血清中 lncRNA 的表达在肝癌中诊断效能的比较应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)进行比较，所有统计学检验均以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 lncRNA-ATB 在肝癌组织中的表达

研究证实，多种 lncRNA 在肿瘤组织中的异常表达，在肿瘤发生发展过程中发挥重要的调控作用[4]。为了明确 lncRNA-ATB 在肝癌组织中的表达情况，我们检测肝癌组织中及癌旁组织中 lncRNA-ATB 的表达以明确其表达差异。我们的结果发现，在肝癌组织中，lncRNA-ATB 的表达较癌旁组织显著增高，提示 lncRNA-ATB 可能在肝癌发生发展过程中发挥着促癌基因的作用，我们的这一结果与 Yuan 等的研究结果一致[5]。肝癌组织中lncRNA-ATB 的表达显著高于癌旁组织，见图1。

图1 lncRNA-ATB 在肝癌组织与癌旁组织中的表达情况

2.2 lncRNA-ATB 在健康者与肝癌患者血清中的表达

研究证实血清中的 lncRNA 可以作为肿瘤患者的诊断标记物[8]。那么，肝癌患者血清中 lncRNA-ATB表达是否能够成为肝癌患者诊断的标记物值得我们深入探讨。我们收集了肝癌患者术前血清以及健康体检患者的血清，通过检测两组患者血清中的 lncRNA-ATB明确其在肝癌早期诊断中的应用价值。结果证实，在肝癌患者的血清中 lncRNA-ATB 的表达较正常人血清中的表达显著升高，二者之间比较差异显著，具有统计学意义(P<0.05)。lncRNA-ATB 在肝癌患者血清中的表达显著高于健康者血清中的表达，见图2。

图2 lncRNA-ATB 在肝癌患者血清与健康者血清中的表达

2.3 血清中lncRNA-ATB的表达与肝癌患者临床病理参数之间的关系

为了进一步明确肝癌患者血清中 lncRNA-ATB 的表达在肝癌进展过程中发挥的重要作用，我们还分析了 lncRNA-ATB 的表达与肝癌临床病理参数之间的关系。根据 lncRNA-ATB 的中位表达将 lncRNA ATB分为高 lncRNA-ATB 表达组与低 lncRNA-ATB 表达组并进一步分析 lncRNA ATB 表达与肝癌患者临床病理参数之前的关系。我们发现 lncRNA-ATB 的表达与肝癌患者的年龄，性别等参数无关，但是与患者的肿瘤大小、分化程度、TNM 分期等参数密切相关，见表1。

2.4 血清lncRNA-ATB 表达对肝癌诊断价值分析

既往的研究证实，多数肝癌患者就诊时已属晚期，丧失了手术机会，是导致肝癌患者预后不良的重要原因。那么 lncRNA-ATB 在肝癌诊断中是否具有潜在应用价值值得我们进一步分析明确。分析其在肝癌中患者中的表达及在诊断中的意义，我们的结果提示，应用血清中 lncRNA-ATB 的表达诊断肝癌患者的 AUC 为0.9462，见图3。

图3 血清中 lncRNA-ATB 在肝癌中的诊断价值

表1 肝癌患者血清中 lncRNA-ATB的表达与临床病理参数之间的关系

3 讨 论

我国肝癌患者发病率每年都在增长[9]。肝癌患者早期症状不明显，发现时多数已属晚期，失去手术机会，同时肝癌缺少有效的治疗手段，使得肝癌患者的生存率显著降低。在精准医疗时代，我们需要更加努力找寻与肝癌相关的诊断标记物，为提高肝癌的诊断率提供新的实验依据[10]。目前研究表明，lncRNA 在疾病的诊断中具有重要的潜力，有望成为新的肿瘤诊断标记物[11]。

lncRNA 其长度大于200 nt，是 RNA 聚合酶II 的转录产物，研究发现，多数 lncRNA 分布与细胞核中，少部分 lncRNA 特异性分布于细胞浆中[12-13]。 lncRNA 的二级结构包括双茎结构以及3’端的三叶草结构。目前关于 lncRNA 的三级结构尚未确定，其结构分散，缺乏紧密连接的核心结构。随着人们对 lncRNA 认识的深入，发现 lncRNA 虽然不编码蛋白，但是却具有复杂的生物学功能，在疾病进展中发挥着重要作用[12，14-15]866-883。普遍的研究认为，lncRNA 有望在肿瘤诊断，精准靶向治疗的应用中具有重要的潜力[16]。研究证实，H19[17]、FERL4[18]均能作为胃癌的诊断标记物。伴随着测试技术的飞速发展，更多具有强大功能的 lncRNA 被发现，使得 lncRNA 从最初的“暗物质”成为如今的“明星分子”。基于这些研究成果，我们认为 lncRNA 在血清中作为肿瘤早期诊断标记物是可行的。LncRNA-ATB 是位于 chr14(q11.2) 上的 poly(A) -阴性的 RNA[3]37-46。既往的研究证实 lncRNA-ATB 在肝癌侵袭转移以及 EMT 过程中发挥着重要的调控作用，而且其表达上调与肝癌患者的预后不良密切相关[5]666-681。目前的研究多数集中在 lncRNA-ATB 功能及机制的研究，对于其在临床诊断中作用的报道较少。为了探索lncRNA-ATB 在肝癌诊断中的作用，我们首先检测了 lncRNA-ATB 在肝癌组织中的表达，发现在肝癌组织中 lncRNA-ATB 在肝癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，这一结果与 Yuan 等的研究结果一致[5]666-681，同时这一结果也为进一步探讨 lncRNA-ATB 在肝癌患者血清中的表达奠定了基础。我们在血清中检测 lncRNA-ATB 的表达证实 lncRNA-ATB 在肝癌患者的血清中较正常健康人的血清中表达显著增高，分析血清中 lncRNA-ATB 的表达与肝癌患者临床病理参数之间的关系证实 lncRNA-ATB 的表达与肝癌患者的年龄、性别等参数无关，但是与患者的肿瘤大小、分化程度、TNM 分期密切相关，这一结果提示 lncRNA-ATB 不仅参与了肝癌的进展，还有望成为肝癌诊断的新型标记物，同时也有作为肝癌分期标记物的潜在应用价值。为了进一步明确 lncRNA-ATB 在肝癌诊断中的价值，通过分析证实血清中 lncRNA-ATB 的表达量诊断肝癌的AUC 为 0.9462，这一结果说明外周血中 lncRNA-ATB 的表达在辅助肝癌诊断中具有确切的诊断效能。目前已有多个中心的研究证实血清中 lncRNAs 在肿瘤诊断中具有巨大的应用价值[19]，研究结果也为 lncRNA 在肿瘤诊断中的应用提供了新的实验数据。

综上所述，我们发现肝癌患者组织中 lncRNA-ATB 高表达，同时患者血清中的lncRNA-ATB 亦较健康者血清中表达升高，而且这种升高与肝癌的多个病理参数具有明显相关性，同时还证实了 lncRNA-ATB 的表达对诊断肝癌具有较高的诊断效能，有望在临床应用中作为肝癌诊断以及病情评估的新型标记物。