诺如病毒RNA检测的性能验证与临床应用*

汪自然，陈雨，伊洁，吴洁(中国医学科学院北京协和医院检验科，侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京100730)

诺如病毒(norovirus)，又叫诺瓦克病毒，是一种无包膜、单链正向的RNA病毒[1]。人类诺如病毒是世界范围内急性肠胃炎的主要病原体，每年约6.99亿人感染，约占全球所有肠胃炎病例的1/5[2]。诺如病毒可以引起腹泻、呕吐、恶心、低烧和腹部绞痛等症状，在新生儿、老年人和免疫功能低下的人群中感染率较高。人与人之间的病毒传播主要通过污染的水和食物，人群对诺如病毒普遍易感，感染后不能获得长久的免疫力。目前诺如病毒的主要检测方法包括电镜检测法、免疫检测法、分子生物学检测方法等[3]。其中，实时荧光定量PCR法因其较高的灵敏度和特异性，是当下临床诊断诺如病毒感染的可靠方法。本研究对诺如病毒RNA检测试剂盒的各项性能进行评价并评估诺如病毒的临床感染现况。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher公司)，核酸提取仪、磁珠法核酸提取纯化试剂(上海伯杰公司)，诺如病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法，湖北朗德公司)；逆转录酶(江苏康为世纪公司)，2×Taq预混PCR反应液(北京康润公司)。

1.2方法

1.2.1核酸提取 按照提取试剂说明书操作，主要提取步骤包括：裂解、吸磁珠、漂洗、洗脱、弃磁珠。

1.2.2PCR扩增及测序 提取得到的RNA首先逆转录为cDNA，逆转录反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。逆转录后以cDNA为模板，分别使用GⅠ或者GⅡ引物进行扩增。引物序列如下：GⅠ-F：5′-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3′，GⅠ-R：5′-CCAACCCARCCATTRTACA-3′； GⅡ-F：5′-CARG

ARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3′，GⅡ-R：5′-CCR

CCNGCATRHCCRTTRTACAT-3′，由北京睿博兴科公司合成。PCR反应条件为：预变性94 ℃ 2 min；变性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共32个循环；终延伸72 ℃ 7 min后转入4 ℃保存。PCR产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳后出现条带的初步判定为阳性。扩增产物送至北京睿博兴科公司测序，仪器为ABI 3730XL测序仪，测序引物使用默认参数，测序试剂为BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(美国Thermo Fisher公司)。将测序后双向拼接得到的序列于NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，与数据库中诺如病毒的基因序列比对一致的认为该样本诺如病毒RNA检测阳性。对于无扩增条带的认为该样本诺如病毒RNA检测阴性。

1.2.3实时荧光定量PCR 按诺如病毒RNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书操作，反应条件为：42 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min(采集荧光信号)，共40个循环。选择FAM检测通道检测诺如病毒RNA；选择VIC通道检测内标。在质控品及内标实验结果均有效的前提下，如果FAM通道扩增曲线呈S型且循环阈值(Ct)≤36.00，则结果判定为阳性。

1.3性能验证方案及指标 性能验证主要按照中 国 合 格 评 定 国 家 认 可 委 员 会 (China National Accreditation Service, CNAS)《医学实验室质量和能力认可准则及其在分子诊断领域的应用说明》(CNAS-CL02-A009)[4]文件执行。

1.3.1重复性 选取含1×104copies/mL、1×105copies/mL诺如病毒阳性质控品和诺如病毒阴性质控品各1例，每一种标本重复测定5次，测定4 d，每份样本共测定20次，计算每种标本的符合率及Ct值的批内和批间精密度。性能验证通过标准：阴性、阳性符合率均应≥95%，批内和批间的变异系数(CV)应符合说明书的声明范围(≤5%)。选取含1×104copies/mL、1×105copies/mL诺如病毒阳性质控品和诺如病毒阴性质控品各1例，由不同的操作人员使用同一批号试剂在同一台仪器上完成检测，操作人员检测结果与实际结果阴性、阳性结果符合率均应为100%。

1.3.2符合率 20例疑似诺如病毒感染的患者粪便样本随机排列，以PCR扩增及测序法结果为金标准，使用诺如病毒RNA检测试剂盒对样本进行平行检测，计算符合率。性能验证通过标准：阴性、阳性检出率均应≥95%。

1.3.3检测下限 选取诺如病毒核酸1×105copies/mL、1×104copies/mL和1×103copies/mL质控品，每一种质控品重复检测20次，计算符合率。性能验证通过标准：1×105copies/mL和1×104copies/mL浓度的RNA检出率均应≥90%。

1.3.4抗干扰能力 在经PCR及测序比对鉴定为诺如病毒RNA阳性的粪便样本中分别加入以下物质：含血红蛋白(100 g/L)的血液、 阿莫西林(5 μg/mL)、对乙酰氨基酚(0.15 μg/mL)、布地奈德混悬液(0.5 mg/mL)，将加入干扰物质的标本全部提取核酸，检测加入干扰物质和未加入干扰物质的标本，统计其Ct值。性能验证通过标准：未加入干扰物质样本的Ct值应在加入血或药物样本的Ct值的95%置信区间内，否则为抗干扰能力差。

1.3.5交叉反应 分别将检验科保存的大肠埃希菌菌液(1.0×106CFU/mL)、肠炎沙门菌菌液(1.0×106CFU/mL)、宋内志贺菌菌液(1.0×106CFU/mL)和艰难梭菌菌液(1.0×106CFU/mL)的标本分别加入诺如病毒阴性标本中，使用诺如病毒核酸试剂盒进行检测。性能验证通过标准：不应出现阳性扩增曲线或Ct值，否则为特异性差。

1.4临床样本检测 收集北京协和医院2020年12月至2021年7月各科室疑似诺如病毒感染患者的粪便样本共4 179例，其中男性1 883例，年龄中位数为34岁；女性2 296例，年龄中位数为34岁。使用诺如病毒核酸检测试剂盒进行检测，并计算阳性率。

1.5统计学分析 用SPSS 16.0软件分析。计算95%置信区间及阴性、阳性检出率，各组间阳性率的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1性能验证结果

2.1.1重复性验证 1×104copies/mL、1×105copies/mL诺如病毒阳性质控品和诺如病毒阴性质控品使用试剂检测，符合率为100%，符合性能验证标准。1×104copies/mL阳性质控品的批内CV为0.40%，批间CV为2.77%。1×105copies/mL阳性质控品的批内CV为0.69%，批间CV为2.68%。CV均小于5%，符合说明书要求。不同操作人员检测结果与实际结果的符合率均为100%。

2.1.2符合率验证 20例粪便样本提取核酸后，以逆转录的cDNA为模板，分别使用GⅠ和GⅡ的引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表明20例样本中3例扩增有条带，且均为GⅡ型(图1)。对有扩增的条带进行DNA测序，测序结果与NCBI数据库比对，结果与诺如病毒序列高度一致，表明相应样本确证为诺如病毒检测阳性。20例样本测序结果表明，3例为阳性，17例为阴性。部分阳性样本测序峰图见图2。对20例临床样本使用试剂盒检测，3例检测为阳性，17例检测为阴性，与测序结果一致，符合率为100%，符合性能验证标准，见表1。

注：A，GⅠ基因扩增结果；B，GⅡ基因扩增结果。M, DL 2 000 DNA marker; 1～20，20例临床样本。

图2 诺如病毒核酸阳性样本测序部分结果

表1 20例临床样本PCR-荧光探针法与测序法比对结果

2.1.3检测下限验证 1×105copies/mL、1×104copies/mL和1×103copies/mL诺如病毒质控品使用试剂盒重复检测20次，检测结果均为阳性，检测下限可以达到1×103copies/mL，而试剂标明的检测下限为1×104copies/mL，检测下限符合性能验证标准。

2.1.4抗干扰能力验证 在确证为诺如病毒RNA阳性的样本加入各干扰物质后提取核酸，使用试剂检测，所得Ct值的95%置信区间为18.08～19.76，而未加干扰物质的对照样本Ct值为19.19，在95%置信区间内，抗干扰能力符合性能验证标准。见表2。

2.1.5交叉反应验证 在确证为诺如病毒RNA阴性的样本中分别加入大肠埃希菌、肠炎沙门菌、宋内志贺菌或艰难梭菌菌液后提取核酸，使用试剂检测，均未出现阳性扩增曲线或Ct值，交叉反应符合性能验证标准。见表2。

表2 诺如病毒核酸检测试剂抗干扰能力和交叉反应验证

2.2临床样本检测结果 4 179份临床样本中阳性样本517例，总阳性率为12.37%。其中，男性患者(13.91%，262/1 883)阳性率高于女性患者(11.11%，255/2 296)，差异有统计学意义(χ2=7.523，P=0.006)。不同月份阳性率差异有统计学意义(χ2=140.6，P<0.001)，2021年3～4月阳性率处于较高水平，2021年6～7月阳性率较低，见图3A。从年龄分布来看，21～40岁的患者的阳性率高于其他年龄组(χ2=68.83，P<0.001)，见图3B。从科室分布分析，门急诊及病房均有阳性样本检出，发热门诊阳性样本检出量最高，急诊儿科阳性率较高,见图3C。

注：A，不同月份诺如病毒阳性率分布；B，不同年龄组诺如病毒阳性率分布；C，不同临床科室阳性率分布。

3 讨论

近年来，由诺如病毒引起的暴发感染得到了越来越多的关注。诺如病毒具有高度传染性，即使是少量的病毒也能致病，被感染的人会释放大量的病毒颗粒污染周围环境[5-6]。对于儿童、老人和免疫功能缺陷的人群，一旦感染诺如病毒，可能导致脱水、休克甚至死亡[7]。因此，早期识别诺如病毒的感染者、及时隔离感染者和消毒周围环境是控制诺如病毒感染暴发的重要环节。目前针对诺如病毒有多种检测方法，而荧光定量PCR方法准确高效且检测通量较大，可以满足临床的检验需求。

依据医学实验室认可国际标准IS015189《医学实验室质量和能力专用要求》、美国病理家学会(College of American Pathologists，CAP)和《医疗机构临床实验室管理办法》等相关文件要求，特定的试剂或者检测系统在应用于临床检测之前，需要对其进行性能验证以确保其能符合临床需求[8-10]。本研究从重复性、符合率、检测下限、抗干扰能力和交叉反应5个方面对诺如病毒核酸检测试剂进行系统评价。在重复性研究中，选取2个浓度的诺如病毒核酸质控品和阴性质控品，每种样本每天检测5次，检测4 d，共20次检测，符合率为100%，批内和批间CV均<5%，说明试剂较为稳定，重复性好。不同操作人员检测结果与实际结果均一致，说明人员之间重复性较好。在准确性研究中，收集发热门诊20例疑似诺如病毒感染的患者粪便样本，使用核酸提取仪提取核酸后逆转录为cDNA。诺如病毒GⅠ和GⅡ是引起人类胃肠炎的2个主要基因型[11]，本研究以cDNA为模板，分别使用相应的引物扩增后对阳性条带进行测序比对，结果表明20例临床样本中3例为诺如病毒核酸阳性，且基因型均为GⅡ。这与国内报道GⅡ型为主要流行型的其他研究[11-12]相一致，后期可以收集更多的样本进行基因测序和遗传进化树分析，以监测诺如病毒在本地区的流行型别及传播规律。以测序比对结果为金标准，使用诺如病毒检测试剂盒对20例临床样本进行检测，符合率为100%，表明试剂盒检测较为可靠，准确性高。试剂盒标明的检测下限为1×104copies/mL，选择高于、等于和低于该下限的3个浓度的质控品进行验证，每种样本重复20次，检出率均为100%，说明检测系统具有较高的敏感性，检测下限符合性能验证要求。在抗干扰能力检测中，在诺如病毒确证阳性的粪便样本中混入血液和常见的抗病毒药物作为干扰物质，分别提取核酸后使用试剂盒检测，结果显示未加入干扰物质的Ct值在加入血或药物的Ct值的95%置信区间内，表明该试剂盒抗干扰能力较好，血液和常见的药物对其检测结果影响较小。目前有较多的病原体均可以引起发热、腹泻等症状，为了避免其他病原体造成的假阳性结果，在诺如病毒阴性的样本中加入常见腹泻相关的细菌菌液后提取核酸检测，结果均未出现阳性扩增曲线或者Ct值，说明特异性较高。

近年来，在北京市各区均存在诺如病毒引起的散发或暴发疫情。本研究中，诺如病毒的总阳性率为12.37%，与既往北京市哨点医院监测数据[13]相类似。本研究结果提示在3～4月阳性率处于较高水平，这可能与季节更替导致人群免疫力下降有关。同时，干冷的天气环境也有利于诺如病毒的生长繁殖和传播[14]。既往研究大多关注婴幼儿人群中诺如病毒的感染情况[15]，但本研究中21～40岁年龄组相较于儿童患者具有较高的感染率，这可能与我院为综合医院，收治儿童患者较少有关。因此，在后续的监测中，青壮年群体的诺如病毒的感染情况也需要关注。发热门诊的阳性病例数较多，一方面说明诺如病毒感染的患者往往有发热等症状，同时也提示在发热门诊需要做好环境的消毒工作，以免疫情的进一步扩散。急诊儿科阳性率较高，表明儿童群体免疫力相对弱，对诺如病毒易感性强，需要密切监测以防止群体疫情的暴发。

本研究也存在一定的局限性：在交叉反应验证中，宜选择与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸进行验证，而在本研究的交叉反应验证中限于实验条件，仅选择了腹泻相关的常见细菌，并未验证轮状病毒、腺病毒、札如病毒、星状病毒等胃肠道相关病毒的交叉反应性。

综上，该检测试剂稳定、重复性好，结果准确可靠、敏感性高，抗干扰能力和特异性较高，符合性能验证的要求，可为临床诺如病毒感染诊断提供可靠的病原学依据。该检测系统连续8个月的监测结果表明，诺如病毒在人群中具有较高的感染率，尤其是在季节交替时和21～40岁群体中，需要持续的关注和监测。