血清维生素D水平和维生素D受体基因多态性与肥胖型哮喘儿童的相关性分析

张欢欢，王娟，李超

作者单位：1驻马店市第一人民医院新生儿重症，河南 驻马店463000；

2驻马店市第四人民医院医务科，河南 驻马店463000

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，发病机制涉及多种炎性细胞、炎性因子和炎性递质［1-2］。中国儿童哮喘的患病率呈上升趋势，尤其是年幼儿童［3-5］。2014 年全球哮喘防治创议指南提出了一种新的哮喘分型-肥胖型哮喘，该型病人临床表现重、对常规哮喘治疗药物反应差、病情控制不理想、生活质量低下［6］。维生素D 受体（vitamin D receptor，VDR）基因位于12q13.11 号染色体上，包含11 个外显子，其单核苷酸多态性（single nucleotide polymor‑phisms，SNP）与自身免疫性疾病、哮喘和肥胖症密切相关［7-9］。本研究主要检测维生素D 水平和VDR基因多态性与肥胖型哮喘发病的相关性，以期为肥胖型哮喘的预防和治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料前瞻性分析2016 年10 月至2019年10 月在驻马店市第一人民医院小儿呼吸内科收治的141例儿童哮喘病儿，均符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016 年版）》［10］，无其他过敏性疾病、心脏、肾脏和肝脏等主要器官的功能障碍。其中肥胖型哮喘45 例，男25 例，女20 例，年龄（7.2±1.5）岁。非肥胖型哮喘96 例，男57 例，女39 例，年龄（7.6±1.8）岁。收集同期来该院就诊的健康儿童54 例作为对照组，男29 例，女25 例，年龄（7.4±1.8）岁。无哮喘家族史和个人过敏史。三组间性别（χ2=0.50，P=0.780），年龄（t=1.02，P=0.097）比较差异无统计学意义。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病人近亲属签署知情同意书。

1.2 炎性因子、25 羟维生素D［25-hydroxyvitaminD，25（OH）D］和肺功能检测入院时抽取空腹肘静脉血5 mL，4 mL 置于低温（4 ℃）离心机中，1 500 r/min，离心15 min，吸取上层血清，至于EP 管中，放于−80 ℃超低温冰箱中保存待用。剩余1 mL 为抽取DNA 检测实验所用。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测，病人血清中白介素（IL）-4、IL-7、IL-10、IL-17、IL-33 和25（OH）D 的水平，具体的实验步骤严格按照试剂盒说明书进行，ELISA 试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。所有病人接受肺功能检测包括：第1 秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、一秒率、呼气流量峰值（peakexpira‑toryflow，PEF）、残气量/肺活量（residual volume/total lung volume，RV/TLV）。

1.3 全血基因组DNA抽提及基因多态性检测将保存的全血样本，置于37 ℃水浴锅中融化，按照美国Gentra公司提供的PUREGENE全血快速基因组DNA提取试剂盒中300µL全血提取基因组DNA的有机溶剂沉淀法进行抽提基因组DNA。抽提的DNA溶解于100µL DNA水合液中，放置65 ℃水浴中1 h，然后检测抽提基因组DNA的浓度和纯度。通过Haploview软件、文献查阅等方法选择VDR的SNP位点rs731236、rs1544410、rs1168271和rs2228570，PCR扩增及延伸引物由Array Designer 软件设计，北京华大基因科技有限公司合成。rs731236正向引物5´-GGTGGGATTGAGCAGTGAG-3´，反向引物5´-CTTCTGGATC ATCTTGGCATA-3´，rs1544410正向引物5´-GAGGGAGGGAGGAAGGAA-3´，反向引物5´-CTG TAGCAATGAAATCAAACCA-3´，rs1168271正向引物5´-GTGTGTTGGACAGGCGGT-3´，反向引物5´-GCAGTGGTATCACCGGTCA-3´，rs2228570正向引物5´-GGCTCCGAAGGC ACTGTG-3´，反向引物5´-CATAGCATTGAAGTGAAAGCCA-3´。利用SNP基因分型检测试剂盒（美国赛默飞世尔科技有限公司）检测选取位点的基因多态性。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0 软件统计分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD 法，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。肥胖型哮喘与SNP位点基因型的关联采用logistic回归模型进行分析，统计结果以优势比（OR）和95% 置信区间（95%CI）的形式给出。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 比较三组儿童炎性因子、25（OH）D 水平肥胖型哮喘组外周血中炎性因子IL-4、IL-7、IL-10、IL-17 和IL-33 与对照组比较均差异有统计学意义，肥胖型哮喘组外周血中25（OH）D 水平低于非肥胖型哮喘组和对照组（P<0.05）。见表1。

表1 三组儿童外周血中炎性因子和25（OH）D的检测水平比较/± s

表1 三组儿童外周血中炎性因子和25（OH）D的检测水平比较/± s

注：IL-4为白介素-4，IL-7为白介素-7，IL-10为白介素-10，L-17为白介素-17，L-33为白介素-33，25（OH）D为25羟维生素D。①与对照组比较，P<0.05。②与非肥胖型哮喘组比较，P<0.05。

组别对照组非肥胖型哮喘组肥胖型哮喘组F值P值25（OH）D/（µg/L）35.6±6.5 23.1±3.5①18.6±3.2①②53.41<0.001例数54 96 45 IL-4/（ng/L）11.4±2.1 42.7±6.3①40.3±4.7①460.12<0.001 IL-7/（ng/L）5.2±1.4 13.4±2.5①12.6±3.1①104.45<0.001 IL-10/（ng/L）17.6±2.7 5.6±1.8①5.2±1.5①355.10<0.001 IL-17/（ng/L）19.2±5.4 52.4±9.2①55.8±8.6①167.86<0.001 IL-33/（ng/L）61.2±10.6 142.6±14.2①139.3±15.2①535.88<0.001

2.2 比较三组儿童肺功能检测结果三组间FEV1、FVC、一秒率、PEF和RV/TLV比较均差异有统计学意义，且肥胖型哮喘组FEV1、一秒率低于非肥胖型哮喘组和对照组，RV/TLV 高于非肥胖型哮喘组和对照组，FVC 和PEF 低于对照组（均P<0.05）。见表2。

表2 三组儿童肺功能检测结果比较/± s

表2 三组儿童肺功能检测结果比较/± s

注：FEV1为第1秒用力呼气容积，FVC为用力肺活量，PEF为呼气流量峰值，RV/TLV为残气量/肺活量。①与对照组比较，P<0.05。②与非肥胖型哮喘组比较，P<0.05。

组别对照组非肥胖型哮喘组肥胖型哮喘组F值P值RV/TLV/%34.5±5.6 46.3±11.4①56.2±10.2①②39.57<0.001例数54 96 45 FEV1/L 90.7±7.3 75.8±8.7①65.2±5.8①②66.90<0.001 FVC/L 86.5±10.5 56.5±8.1①50.3±79①123.54<0.001一秒率/%81.7±7.2 63.4±6.1①58.6±5.9①②43.88<0.001 PEF/（L/s）86.8±11.4 62.5±7.4①58.4±6.2①52.74<0.001

2.3 三组儿童不同基因位点基因型和等位基因频率分布比较三组儿童rs2228570 位点AA、AG、GG基因型和A、G 基因频率分布差异有统计学意义。见表3。

2.4 三组儿童VDR rs2228570 基因型多因素logis⁃tic回归分析选择表3中三组间差异有统计学意义的VDR rs2228570 基因型行logistic 回归分析，AA 为肥胖型哮喘的发生的危险因素，GG 为肥胖型哮喘的发生的保护因素。见表4。

表3 三组儿童不同基因位点基因型和等位基因频率分布比较

表4 三组儿童VDR rs2228570基因型多因素logistic回归分析结果

3 讨论

儿童哮喘主要由白介素、白三烯、T 淋巴细胞和嗜酸性粒细胞引起的气道炎症反应。在本研究中，非肥胖型哮喘组和肥胖型哮喘组与对照组相比IL-4、IL-7、IL-17和IL-33炎性因子的水平升高，IL-10的水平降低。IL-4、IL-7 和IL-17 可诱导炎性因子和趋化因子的表达，IL-33 与其受体结合后可激活NF-κB和MAPK 信号通路，从而调节炎症反应［11-12］。IL-10对细胞的生长与分化有一定的调节作用，也可直接参与机体的炎症反应和免疫应答，为目前公认的一种炎症和免疫抑制因子［13］。非肥胖型哮喘组和肥胖型哮喘组间炎性因子水平却无差异，炎性因子IL-4、IL-7、IL-17 和IL-33 和低水平的IL-10 在肥胖型哮喘儿童中监测的临床价值不大。在哮喘的发病过程中，长期的炎症刺激导致气道高反应性，使气道痉挛狭窄［14-15］。在本研究中，肥胖型哮喘组的通气测定指标FEV1、FVC、一秒率和PEF 明显低于非肥胖型哮喘组和对照组，肥胖型哮喘组肺容量检测指标RV/TLV 比值显著高于非肥胖型哮喘组和对照组。因此，肥胖型哮喘组儿童气道功能障碍和气流受限较非肥胖型哮喘组严重。

25（OH）D 与糖蛋白配体结合后，激活细胞核内的三磷酸腺苷信号通路传导，抑制炎性因子激活，减轻炎性因子对于支气管平滑肌的影响，保护平滑肌细胞膜的完整性［16-17］。本研究中病人外周血中25（OH）D 的水平在肥胖型哮喘中的水平显著低于非肥胖型哮喘组和对照组，对肥胖型哮喘的监测可能具有一定的临床意义。1，25-二羟基维生素D3通过抑制气道炎症过程中趋化因子的产生来减少气道炎症，气道高反应性和气道重塑［18］。研究显示，哮喘病人VDR FokI 基因中TT 基因型和T 等位基因携带者的频率显著高于对照组［19］。Rodrigues 等［20］研究显示，哮喘儿童中ApaI的多态性等位基因（TT）似乎是哮喘的危险因素，而超重的儿童中，BsmI 的多态性等位基因似乎是哮喘的危险因素。在本研究中，肥胖型哮喘组VDR rs2228570位点AA 基因型为肥胖型哮喘的发生的危险因素，GG 基因型为肥胖型哮喘的发生的保护因素。综上所述，肥胖型哮喘中维生素D水平显著降低，AA基因型为肥胖型哮喘的发生的危险因素，GG 基因型为保护因素，为肥胖型哮喘的预防和治疗提供新的方向。