超声和剪切联合超临界CO2法制备姜黄素脂质体

骆靓芸

（1.阿泽雷斯国际贸易有限公司，上海 201900；2.上海交通大学 化学化工学院，上海 201100）

近年来，姜黄素俨然已成为天然药物研究热点之一，其具有治疗炎症、缓解关节疼痛、降低高血压、抑制肿瘤细胞增殖等药理活性[1]。但是姜黄素本身水溶性差，光照下易分解，在中性或碱性条件下易降解，在人体中容易被快速代谢而失去活性，导致其生物利用度极低[2]。针对其应用局限性，学者们研究了各种姜黄素剂型，如乳液、纳米颗粒、脂质体等。其中，脂质体具有独特优势：（1）解决了水溶性差和稳定性差等问题；（2）对人体安全无毒，具有生物降解性；（3）具有更好的生物相容性，可以提高姜黄素细胞渗透率；（4）容易在肝脏等部位富集，具有靶向富集效果[3]。超临界CO2法是一种新型绿色制备脂质体的方法，与传统制备方法相比，其具有工艺简单、条件可控、无溶剂残留等优势[4-7]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；姜黄素，95%，河南晨光科技有限公司；大豆磷脂，98%，北京美亚斯磷脂技术有限公司；胆固醇，95%，阿达玛斯试剂（上海）有限公司。

765PC紫外分光光度计，上海光谱仪器厂；SY1200超声振荡仪，上海声源超声波仪器；JEM-2100透射式电子显微镜，日本电子株式会社；ZS90纳米粒度分析仪，英国马尔文仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 姜黄素标准曲线

将姜黄素稀释配制得到2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L和10 mg/L姜黄素梯度溶液，以425 nm处吸光度（A）对姜黄素浓度（W）进行线性回归，获得姜黄素标准曲线：A=0.114 2W+0.061 8，R2=0.998 9。

1.2.2 姜黄素脂质体制备条件优化

1.2.2.1 制备流程

姜黄、大豆磷脂和胆固醇在研钵中研磨成饼状，分次加入30 mL的PBS磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH=6.0），继续研磨至均匀后加入高压釜。在剪切、45 ℃条件下，通入超临界CO2直至设定压力后开启超声，保持超声和剪切共同处理40 min。依次停止加热、剪切和超声，释放CO2。加入100 mL的PBS磷酸缓冲溶液冲洗釜内壁上的黄色颗粒，超声和搅拌共同处理40 min，即得姜黄素脂质体溶液。

1.2.2.2 剪切速度优化

压力20 MPa，温度45 ℃，大豆磷脂占总脂质（磷脂和胆固醇总和）质量的83%，姜黄素占总脂质质量的5%，超声功率45 W，超声和剪切处理40 min，剪切速度分别设置为1 000 r/min、3 000 r/min、5 000 r/min和 7 000 r/min。

1.2.2.3 超声功率优化

压力20 MPa，温度45 ℃，大豆磷脂占总脂质质量的83%，姜黄素占总脂质质量的5%，剪切速度5 000 r/min，超声和剪切处理40 min，超声功率分别设置为0.0 W、22.5 W、45.0 W和180.0 W。

1.2.2.4 大豆磷脂添加量优化

压力20 MPa，温度45 ℃，姜黄素占总脂质质量的5%，剪切速度5 000 r/min，超声功率45 W，超声和剪切处理40 min，磷脂质量分别为总脂质的50%、67%、83%和100%。

1.2.2.5 姜黄素添加量优化

压力20 MPa，温度45 ℃，磷脂添加量占总脂质的83%，剪切速度5 000 r/min，超声功率45 W，超声和剪切处理40 min，姜黄素质量分别为总脂质的3%、5%、8%和10%。

1.2.3 姜黄素脂质体包封率的测定

将姜黄素脂质体溶液混合均匀后在425 nm处测量吸光度 A1，计算Wz；溶液离心（5 000 r/min，15 min）后取上清液测量吸光度A2，计算W1。包封率（EE）的计算公式如（1）所示：

1.2.4 姜黄素脂质体粒径分布

姜黄素脂质体溶液用去离子水稀释50倍至清澈透明状态，在马尔文粒度仪上测量姜黄素脂质体粒径和粒径分布。

1.2.5 姜黄素脂质体形貌表征

姜黄素脂质体溶液离心（5 000 r/min，15 min）后取上清液，用4 μm滤膜过滤后滴在300目覆有碳膜的铜网上，待样品完全干燥，观察姜黄素脂质体微观结构。

1.2.6 姜黄素脂质体体外释放分析

PBS缓冲溶液（pH=7）和乙醇以1∶25的体积比混合作为释放介质，称取姜黄素溶解于释放介质制成和姜黄素脂质体相同浓度的溶液，将姜黄素脂质体和姜黄素溶液放入已经预处理过的孔径0.001 μm滤袋中，夹紧开口后浸入100 mL的释放介质中，（37±0.5）℃水浴搅拌，分别于 0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、12.0 h和24.0 h取5 mL样品，取样后立即补充5 mL空白释放介质。分别测量各个样品425 nm下的吸光度，计算其累积释放率[3]。

2 结果与分析

2.1 制备工艺优化

由于姜黄素水溶性极差，通过湿法研磨前处理可以使磷脂分子包裹姜黄素均匀混合。采用高速剪切设备来破坏超临界CO2和水相之间的界面张力以及水膨胀的大豆磷脂凝聚，磷脂分子在剪切应力作用下形成球形胶束，释放CO2后形成球形双层分子层囊泡，将表面张力降低至零。超声和剪切联合作用会使得脂质体颗粒更小，分布更均匀，所以超声和剪切作用是该方法的关键[4]。

2.1.1 剪切速度

如图1所示，随着剪切速度的提高，姜黄素脂质体包封率显著升高后变化平缓，粒径减小。当转速达到5 000 r/min时，包封率达到最大，为87.45%±0.30%；粒径为323.00 nm±2.86 nm。因此，选择5 000 r/min作为最佳的剪切速度参数。

图1 剪切速度对姜黄素脂质体的影响

2.1.2 超声功率

如图2所示，随着超声功率的增加，姜黄素脂质体包封率显著升高，达到最大值后略有下降；粒径则先减小后增加。当超声功率为45 W时，包封率最高，为87.11%±0.21%，此时粒径为321.50 nm±13.40 nm。过度超声会引起脂质体融合，导致脂质体泄漏，粒径变大，分布不均匀[8]。因此，以45 W作为最佳超声功率。

图2 超声功率对姜黄素脂质体的影响

2.1.3 大豆磷脂添加量

如图3所示，随着大豆磷脂添加量变大，姜黄素脂质体包封率先升高后降低，粒径则持续减小。当大豆磷脂添加量为83%时，包封率最大，为78.82%±0.47%；当大豆磷脂添加量为100%时，脂质体粒径最小，为165.93 nm±7.98 nm。通常情况下，适量胆固醇的加入可以提高脂质膜的流动性，比单一大豆磷脂组成的双分子层膜稳定性更好[9]。因此，综合考虑以83%作为大豆磷脂的添加量。

图3 大豆磷脂添加量对姜黄素脂质体的影响

2.1.4 姜黄素添加量

如图4所示，随着姜黄素添加量升高，姜黄素脂质体包封率逐渐下降，粒径持续变大。姜黄素含量为3%时，包封率最大，为94.23%±0.22%；粒径最小，为171.13 nm±13.60 nm。研究证实，姜黄素引入脂质双分子层结构中会导致结构松弛，使得脂质体稳定性变差，脂质体颗粒尺寸增大[10]。因此，综合考虑以5%作为姜黄素的最佳添加量。

2.2 姜黄脂质体微观形貌

如图5所示，由超声和剪切联合超临界CO2法制备得到分布均匀的球形小囊泡，粒径为200 nm左右，外膜平滑颜色较深，中间内核透明，符合脂质体结构特征。

2.3 姜黄素脂质体释放动力学

如图6所示，姜黄素在24 h后累计释放了5.5%，姜黄素脂质体在24 h内持续释放，共释放了53.50%姜黄素，说明姜黄素脂质体在体外具有缓慢释放、提高溶解度的特点。

图6 姜黄素和姜黄素脂质体体外释放曲线

3 结论

本研究中建立了一种新的姜黄素脂质体制备方法，使用超临界CO2代替有机溶剂制备得到包封率较高的姜黄素脂质体，具有操作简单、无溶剂残留、包封率高、粒径均匀等优点，且制备得到的姜黄素脂质体体外释放率是姜黄素的10倍。其中，剪切速度和超声强度对产品影响最大，随着剪切速度的增大和超声强度增强，姜黄素脂质体包封率显著增大，颗粒尺寸明显变小；但剪切速度过大或超声强度过强会导致姜黄素脂质体破裂，影响产品质量。