拟南芥钙依赖蛋白激酶CPK11与ABA响应元件结合因子ABF4相互作用的研究

胡 搏, 刘盈盈, 杨 毅

(四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室， 成都 610065)

钙离子(Ca2+)是细胞内的第二信使,钙离子转运蛋白的EF-hand结构可以结合Ca2+从而传递钙信号[1].钙依赖蛋白激酶CPKs是一类含有丝氨酸/苏氨酸激酶域的蛋白质,是植物中必不可少的钙信号感受器.CPKs在大豆中被第一次发现[2].拟南芥中CPKs家族共有34个成员[3],各成员中具有保守的结构域,分别包括：N端可变域、丝氨酸/苏氨酸激酶域、自抑制域和类钙调素结合域[4].CPKs在植物体内的功能主要体现在能够参与激素相关的反应,如CPKs能够参与植物激素脱落酸ABA信号转导过程[5].此外,CPKs还能调控植物生长发育过程.如CPK32可以调节植物的开花时间等[6].CPK11和CPK24可以共同调节拟南芥花粉管中钾离子通道[7].CPK2和CPK20也能调控花粉管生长[8].

利用酵母双杂交实验证明部分钙依赖蛋白激酶与碱性亮氨酸拉链转录因子(basic leucine zipper,bZIP)家族亚组ABFs存在相互作用[9].分析ABFs的过表达和突变体株系的表型可证明其在ABA信号通路以及非生物胁迫下扮演重要角色[10].说明钙依赖蛋白激酶可以通过与ABFs相互作用参与到ABA信号通路中.拟南芥中ABFs有4个成员,分别是ABF1、ABF2、ABF3和ABF4. ABFs家族成员都具有5个保守序列,分别为N端的C1、C2、C3和一个结合DNA序列的bZIP区域以及C4[11].保守序列中均含有R-X-X-S/T,能够被CPKs和蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 2,SnRK2)磷酸化,从而激活ABFs的转录活性[12].如CPK4和CPK11能够通过磷酸化方式激活ABF1和ABF4[13].CPK32可以和ABF4发生相互作用并且磷酸化ABF4进而调控ABA信号通路相关基因的表达[14].CPK12可以和ABF4发生相互作用,也可以与ABI2相互作用影响拟南芥种子萌发以及幼苗生长[15].

CPK11能够正向调控ABA信号通路,也能够体外磷酸化ABF4[13],因而CPK11可能通过磷酸化ABF4从而影响ABA信号转导.但是CPK11能否与ABF4在植物体内发生直接相互作用进而参与到ABA信号通路中还未见报道.本文通过体外酵母双杂实验以及体内双分子荧光互补实验对CPK11与ABF4蛋白之间的直接相互作用提供了实验依据,对CPKs参与ABA信号通路的分子机制的研究具有补充和丰富的作用,为后续研究植物参与ABA信号通路以及抵御逆境胁迫提供理论和实验支持.

2 材料与方法

2.1 材 料

植物材料拟南芥哥伦比亚野生型Columbia(Col-0)种子由实验室密封常温保存.

实验中使用到的菌株大肠杆菌菌株(Escherichiacoli)、农杆菌菌株(AgrobacteriumStrain)、酵母菌株(Saccharomycescerevisiae),所使用的载体pGADT7、pGBKT7、pSPYNE、pSPYCE均由本实验室于-80 ℃长期保存.

Primestar MAX DNA高保真酶购于诺唯赞公司.dNTPs及反转录试剂盒购于Takara公司.T4 DNA连接酶、同源重组酶、限制性内切酶购于Thermo公司.胶回收纯化试剂盒、质粒小提试剂盒购于北京天根公司.营养缺陷型培养基购于泛基诺科技公司.引物合成以及测序由华大基因公司以及擎科和有康生物科技有限公司完成.

2.2 方 法

2.2.1 目的基因的获取以及载体的构建 从野生型拟南芥中提取总RNA, 通过反转录合成cDNA,详细步骤参考反转录试剂盒说明书.以合成的cDNA为模板,通过设计的特异性的引物(表1)从模板中扩增出所需的目的片段.扩增目的片段所用酶为Primestar DNA高保真酶,扩增程序为DNA变性、退火以及延伸,设置的温度和时间分别为97 ℃15 s、57 ℃15 s以及72 ℃10 s,扩增循环数为34.PCR扩增产物通过琼脂糖凝泳电泳检测目的片段分子大小正确后利用胶回收试剂盒回收纯化目的片段,即获得所需的目的基因CPK4、CPK11以及ABF4.

将目的片段和质粒利用限制性内切酶分别酶切,具体酶切位点见表1.T4 DNA连接酶连接目的片段和质粒的酶切产物,后将连接产物转入大肠杆菌感受态.接着将转入重组质粒的大肠杆菌感受态按照质粒所携带的抗性基因分别涂布于卡那和氨苄抗性培养基上过夜培养.利用菌落PCR技术从抗性培养基上筛选阳性克隆菌落.得到的阳性克隆菌在LB液体培养基中扩大培养后,利用质粒小提试剂盒按试剂盒说明书提取重组质粒pGADT7-ABF4、pGBKT7-CPK11、pSPYNE-CPK11、pSPYNE-CPK4、pSPYCE-ABF4.其中pSPYCE-ABF4重组质粒构建过程中除利用同源重组连接目的片段与载体外其他操作过程同上.最后将获得的重组质粒送擎科以及有康生物科技公司测序.

表1 实验所用引物

2.2.2 氨基酸序列比对及进化树构建 CPK11的氨基酸序列下载于Tair网站,即Arabidopsis Information Resource database(http://www.arabidopsis.org/),CPK11在拟南芥中的同源氨基酸序列下载自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).CPK11的氨基酸序列二级结构用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl)网站预测,利用IBS软件制作蛋白质二级结构域.不同CPKs之间的氨基酸序列的比对利用DNAMAN软件.进化树的构建利用MEGA7.0软件，构建进化树时选择Neighbor-joining邻接法,设置步长值为1000，模型用Kimura 2-parameter Model，缺失数据处理选择部分缺失，完整度设置参数为95.

2.2.3 酵母双杂交实验 根据酵母双杂交实验步骤(Clontech), 利用AH109酵母菌株制备酵母感受态,将重组质粒AD-ABF4+BD-CPK11共转进感受态酵母中作为实验组,实验室保存的AD-CARK3+BD-RCAR12质粒转入酵母感受态作为阳性对照组,转入AD-ABF4+BD以及AD+BD-CPK11重组质粒的酵母感受态作为阴性对照.吸取5 μL酵母菌液滴于氨基酸营养缺陷型固体培养基SD/-Trp-Leu上于30 ℃培养箱中生长2～3 d,并且通过菌落pcr鉴定为阳性菌落,说明共转体系正确.之后将阳性单克隆接种在SD/-Trp-Leu液体培养基中30 ℃,220 r/min振荡培养48 h,用生理盐水将样品OD600调至相同.此后将样品分别稀释10倍,100倍,1000倍后取5 μL滴于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His固体培养基上,30 ℃培养4～6 d观察实验结果.

2.2.4 双分子荧光互补实验 根据双分子荧光互补实验步骤(Lee)[16],将阳性对照NE-CARK3+CE-RCAR12,阴性对照组NE-CPK11/CPK4+CE以及NE+CE-ABF4和实验组NE-CPK11/CPK4+CE-ABF4分别转进农杆菌感受态中,随后涂布于含有卡那、庆大、利福平三种抗生素的YEP固体培养基上生长两天.挑取经过鉴定的阳性克隆菌落于含有卡那、庆大、利福平三种抗生素的YEP液体培养基中28 ℃,220 r/min振荡过夜培养.取菌液低速离心得到沉淀的菌体后,用浸染液重悬菌体,再次4000 r/min离心10 min,重复以上步骤几次后,用浸染液重悬菌体.溶液OD600的值在0.8附近时,将溶液静止避光2 h后,等量混合,用注射器将含有不同质粒的混合农杆菌液一次性注射到烟草叶片中,48 h后利用激光共聚焦显微镜在一定波长的激发光下观察正负对照组以及实验组的荧光情况.

3 结果分析

3.1 CPK11与同源蛋白氨基酸序列比对及亲缘关系分析

拟南芥中CPK11的氨基酸序列下载自TAIR网站,利用SMART网站预测拟南芥CPK11蛋白质二级结构.CPK11共有495个氨基酸,其中从第26到第284个氨基酸为CPK11的蛋白激酶结构域,并且包含了4个EF-hand域(图1a).利用NCBI网站下载了拟南芥中与CPK11属于同一亚家族的CPK4和CPK6.利用DNAMAN软件比对上述CPKs与CPK11氨基酸序列.根据比对结果可知CPK6与CPK11氨基酸序列的相似度为68%,CPK4与CPK11氨基酸序列相似度达95%(图1b).

通过MEGA软件分析拟南芥CPK11与其他钙依赖蛋白激酶CPK1、CPK2、CPK4、CPK5、CPK6、CPK12、CPK20、CPK26的亲缘关系,发现CPK11与其他CPKs亲缘关系由近及远依次为CPK4、CPK12、CPK26、CPK6、CPK5、CPK20、CPK2、CPK1(图1c),其中CPK4与CPK11亲缘关系最近.结合序列比对与亲缘关系分析可知CPK4是与CPK11高度同源的蛋白质.以上结果为研究CPK11同源蛋白的功能提供了相关的理论依据,为后续实验中开展该同源蛋白相关实验研究提供理论支持.

图1 CPK11蛋白质二级结构(a)同源氨基酸序列比对(b)及不同CPKs进化关系分析(c)

3.2 酵母双杂交实验验证CPK11与ABF4体外相互作用

为了探究CPK11与ABF4是否存在体外相互作用,我们利用酵母双杂交实验进行验证.首先将构建成功的载体共转入酵母感受态5 d左右观察酵母在二缺固体培养基(SD/-Leu-Trp)以及三缺固体培养基上(SD/-Leu-Trp-His)的生长情况.观察酵母生长情况可以发现阳性对照组AD-CARK3+BD-RCAR12、阴性对照组AD-ABF4+BD、AD+BD-CPK11和实验组AD-ABF4+BD-CPK11均能在二缺培养基上长出丘状隆起,颜色呈乳白色的酵母菌落(图2左),说明实验体系以及操作正确.观察酵母生长情况发现共转AD+BD-CPK11的酵母感受态在三缺培养基上长出白色菌落,说明BD-CPK11具有自激活现象,故在三缺培养基中加入0.5 mmol/L的3AT抑制此现象.加入3AT的三缺培养基中阳性对照组以及共转CPK11与ABF4的实验组能够长出乳白色酵母菌落,并且随着稀释倍数的增大酵母菌落逐渐减少,而阴性对照组未长出酵母菌落(图2右),证明CPK11与ABF4两者之间存在体外相互作用.

图2 酵母双杂交实验检测CPK11与ABF4体外互作

CPK11与ABF4除存在体外相互作用外,是否也存在体内相互作用?为了验证这一猜想我们随后进行了双分子荧光互补实验.将阳性对照组NE-CARK3+CE-RCAR12,阴性对照组NE-CPK11+CE以及NE+CE-ABF4,以及实验组NE-CPK11+CE-ABF4的农杆菌液注射烟草细胞2 d后,利用共聚焦显微镜在激发光下观察烟草细胞.荧光结果显示,阳性对照组NE-CARK3+CE-RCAR12产生荧光,而阴性对照组NE-CPK11+CE以及NE+CE-ABF4未产生荧光,说明实验体系以及操作正确.实验组NE-CPK11+CE-ABF4在激发光下观察到荧光,同时定位在细胞核中(图3),说明CPK11与ABF4存在体内相互作用.

图3 BiFC验证CPK11与ABF4体内相互作用

3.4 CPK11同源蛋白CPK4与ABF4的体内相互作用

通过图1序列比对以及亲缘关系分析可知CPK4是与CPK11高度同源的蛋白质.蛋白的结构决定蛋白功能,进化关系相近的蛋白往往也具有相似的功能.因此推测CPK4也有可能与ABF4在植物体内具有直接的相互作用.随后利用双分子荧光互补实验来证明此猜想.BiFC实验结果显示:阳性对照组NE-CARK3+CE-RCAR12产生荧光,而阴性对照组NE-CPK4+CE以及NE+CE-ABF4未产生荧光,说明实验体系正确.实验组CPK4与ABF4在激光下能够产生荧光,证明CPK4与ABF4存在体内相互作用,且互作定位在细胞核中(图4).

图4 BiFC验证CPK4与ABF4体内相互作用

植物激素脱落酸ABA在植物生长发育过程中起着关键的调节作用,ABA信号网络已经被逐步阐明[17].通过对ABA信号通路的研究可以明确部分钙依赖蛋白激酶能够正向调控ABA信号通路,已知的如CPK4和CPK11[13]以及CPK6[18]. 拟南芥中CPK4、CPK11、CPK6同属于一个亚家族[3],具有保守的激酶结构域,亲缘关系较近(图1).它们在ABA信号通路中起正调控作用,可以从其蛋白互作底物角度进行阐释.

之前的文章中报道酵母双杂交实验中CPK11与ABF4在四缺固体培养基(SD-Trp-Leu-His-Ade)不表现出直接的相互作用[9,19]. 由于蛋白激酶具有自抑制结构域,猜测可能是CPK11与ABF4的结合位点由于蛋白激酶自抑制结构域的存在而处于出非活性状态,因而表现出较弱的相互作用.因此,本文在酵母实验中使用三缺固体培养基(SD-Trp-Leu-His),发现将含有CPK11与ABF4重组质粒的酵母感受态稀释不同浓度后滴在三缺培养基上能够长出白色酵母菌落,说明两者之间存在体外相互作用(图2),但是相互作用较弱,因此在更加严格的筛选条件下两者之间相互作用不易被检测到.通过酵母双杂交实验证明CPK11与ABF4具有体外相互作用后,本文又通过双分子荧光互补实验进一步证明CPK11与ABF4在植物体内也存在相互作用(图3).同时,本文还证明了CPK11的同源蛋白CPK4可以与ABF4在植物体内发生直接的相互作用(图4).结合之前的研究报道CPK6可以与正调控因子ABF3以及ABI5相互作用[19],说明CPK家族中CPK4、CPK6、CPK11与钙离子结合之后通过与不同的正调控因子进行相互作用,从而调控下游ABA信号通路中相关基因的表达,使植物能够适应环境变化并且迅速作出应答(图5).

图5 CPK11及其同源蛋白在ABA信号通路中的工作模型

本文研究CPK11与ABF4的直接相互作用为钙依赖蛋白激酶家族筛选其潜在底物提供方向,后续可以进一步筛选与CPK11蛋白互作的其他底物.本文对ABA信号通路分子机制的研究具有补充与丰富的作用,为此后研究钙依赖蛋白激酶家族参与调控植物的生长发育及抵御逆境胁迫提供理论和实验依据.