黄连解毒汤通过上调HSP70改善APP/PS1小鼠学习记忆能力＊

谭爱华，冉思邈，石和元，林 谦

（1.北京中医药大学东直门医院/北京中医药大学博士后流动站 北京 100029；2.湖北中医药大学附属黄冈中医医院 黄冈 438000；3.湖北中医药大学基础医学院 武汉 430065）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种严重威胁老年人群健康的神经退行性疾病，其临床表现主要是记忆力减退，认知功能障碍，睡眠结构、人格和行为改变等。随着我国人口老龄化程度的不断加剧，随之而来的老年人群健康问题日渐突显。据预测，2030年我国80岁以上老人将占到总人口的15.83%，而到2050年，这一数据将提升到26.64%[1]，2050年AD患病人数为2015年的2.35倍[2]，将给社会造成巨大的经济负担和看护压力。现代医学中研究发现其病理特征为淀粉样蛋白的沉积、tau蛋白的磷酸化形成的神经纤维缠结、神经炎症导致的细胞异常凋亡等[3]。

热休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSP）是近年抗AD研究中新兴的靶蛋白之一，HSP是AD中常见的一类参与蛋白和伴侣蛋白，可以与非天然蛋白结合并帮助它们获得正常结构，从而抑制蛋白质错误折叠，在抑制Aβ淀粉样蛋白聚集和tau蛋白异常磷酸化中发挥了重要作用，防止在应激条件下发生蛋白错误折叠和聚集过程，因此HSP70被认为是近年来最有希望的抗AD靶标蛋白之一。有研究者报道了在APP/PS1双转基因小鼠的脑组织中检测到HSP70表达水平升高[4]，并发挥了神经保护作用，在本实验研究中也观察到了这一现象。热休克转录因子1（HSF1）是热休克蛋白70（HSP70）的主要调控因子，联系应激反应和炎症反应的重要枢纽。有研究证实通过鼻腔给拟AD小鼠以人的HSP70可以发挥神经保护作用[5]，多项研究报道了替普瑞酮可诱导脑组织中HSP70表达增加[6-7]，因此本研究选择替普瑞酮作为激活HSP70的机制对照药物。

近年来有研究发现黄连解毒汤可以改善拟AD动物的病理变化，黄连解毒汤是主治三焦火毒证的清热解毒名方，出自《肘后备急方》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子组成。古代文献中关于黄连解毒汤治疗类AD病证的记载较少，但现代研究中已经逐渐对本方治疗AD展开研究，如陈国华教授团队对黄连解毒汤治疗AD的临床研究做了系统回顾分析，认为黄连解毒汤联合其他西药或中药治疗可以改善AD患者的认知功能[8]，并探讨了黄连解毒汤对APP/PS1自由基代谢及海马区病理形态学的影响[9]。香港浸会大学李敏教授的团队近期研究发现黄连解毒汤可以明显降低拟AD小鼠脑内的Aβ水平，有效地改善拟AD小鼠的学习记忆能力，其脑内的SP和NFTs也减少了三至四成[10]。本研究以APP/PS1双转基因小鼠为AD动物模型，探讨黄连解毒汤对AD小鼠学习记忆的影响及对HSP70蛋白的调控作用，以期为黄连解毒汤防治AD找到新的生物学基础。

1 材料与方法

1.1 动物

36只SPF级雄性5月龄APP/PS1双转基因痴呆小鼠，12只SPF级雄性5月龄空白对照小鼠，二者均为C57BL/6JNju背景小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0008，质量检测单位：中国医学科学院医学实验动物研究所。动物饲养于湖北中医药大学老年医学研究所动物房，动物房温度控制在（22 ± 2）℃，湿度控制在50%左右，小鼠可自由摄食和饮水，本实验获得湖北中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理审查批号：[2020]IEC012，并严格执行《实验动物管理条例》。

1.2 药物及制备

黄连解毒汤组药物制备：黄连、黄芩、黄柏、（炒）栀子按照1∶1∶1∶1等质量比例，参考国家中医药管理局发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》[11]中标准煎煮流程，加入8倍药物总质量的超纯水浸泡30 min，全自动煎药机“武火”档煎至沸腾10 min，转“文火”档慢煎40 min，煎好后的药液用灭菌纱布袋过滤去渣得药液。将所得汤剂用减压低温冷冻法制成冻干粉，干燥皿中密封保存，用时以超纯水溶解，本实验所用中药饮片均由劲牌持正堂药业有限公司提供，饮片批号分别为：黄连（Y20011013）、黄芩（Y20021027）、黄柏（Y20041082）、（炒）栀子（Y20041088）。所有中药饮片经劲牌持正堂药业有限公司检验室（中国合格评定国家认可委员会认证实验室）检测合格，并经过湖北中医药大学药学院丁莉副教授鉴定，均为合格正品。替普瑞酮胶囊（商品名：施维舒），购自中国人民解放军中部战区总医院，卫材（中国）药业有限公司制造，产品批号：1910078，用时粉碎后以超纯水溶解。

1.3 试剂

无水乙醇（100092683）、中性树胶（10004160）、二甲苯（10023418）、丙酮（10000418）均购自国药集团化学试剂有限公司，多聚甲醛固定液（武汉Servicebio公司，批号G1101），T-Tau兔抗鼠抗体、HSP70兔抗鼠抗体、HSF1兔抗鼠抗体（武汉Servicebio公司，批号分别为 GB11178，GB11241，GB11931），Aβ1-42抗体（美国SIGMA公司，A9810），HRP标记山羊抗小鼠二抗（武汉Servicebio公 司 ，批 号 分 别 GB11096，GB12105，GB12002），山羊抗小鼠荧光二抗（美国ABclonal公司，批号分别为 A0208、A0207、AS001）

1.4 仪器

IVC-BP5型动物独立通气笼架（苏州市苏杭科技器材有限公司）；ZH-0065型Morris水迷宫及视频分析系统（安徽正华生物仪器设备有限公司）；PL-203型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DP2000-1XR型微压循环全自动煎药机（济南博华仪器有限公司）；C-20L-ARE型旋转蒸发器（杭州亿捷科技有限公司）；LGJ-18S（电加热）压盖型真空冷冻干燥机（上海豫明仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；KD-P型组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；Eclipse E100型正置光学显微镜，DS-U3型成像系统（日本Nikon）；DYY-5D型电泳仪，Trans-Blot SD型转膜仪，GelDoc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.5 动物分组及给药

小鼠适应性饲养1周后，按照随机数表法将36只APP/PS1双转基因小鼠分为模型组（记作Model组）、替普瑞酮组（记作GGA组）、黄连解毒汤组（记作HLJD组），每组12只。同系非转基因C57BL/6J小鼠12只作为空白对照组（记作Control组）。HLJD组小鼠灌服黄连解毒汤冻干粉水溶液，给药剂量为相当于生药5.2 g·kg-1·d-1；GGA组小鼠灌服替普瑞酮水溶液，给药剂量为 0.4 g·kg-1·d-1。Control组和 Model组小鼠灌服等体积超纯水，各组小鼠均于每天18:00给药，每日1次，连续给药40天。

1.6 观察指标和检测方法

1.6.1 Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力

参考课题组前期Morris水迷宫实验方法对各组小鼠学习记忆力进行检测[12]，灌胃结束后进行连续5天的定位航行训练，休息24 h后进行空间探查实验。

1.6.2 免疫荧光法检测小鼠皮层和海马区HSP70蛋白

Morris水迷宫实验完成后，从每组小鼠中随机选取3只小鼠，腹腔注射0.3%的戊巴比妥钠溶液，麻醉剂量为0.25 mL·10 g-1，以小鼠皮肤捏夹反应和刺激脚趾反应消失为达到深度麻醉标准。麻醉后的小鼠无菌环境迅速断头，冰上剥离头部皮肤和颅骨，充分暴露全脑，无菌眼科弯镊从枕侧基底部伸入鼻尖侧，轻柔展开向上向外拖拉，完整取出全脑，用无菌的锋利手术刀轻柔切去小脑部分，保留完整大脑组织，生理盐水冲洗大脑表面血渍，立刻放入装有4%多聚甲醛固定液的样本瓶中，4℃避光固定48 h，备用。固定好后进行石蜡包埋，包埋好的组织进行冠状切片，使用二甲苯和梯度乙醇对切片进行脱蜡，脱蜡后用5%BSA封闭修复2 h，修复后用PBS洗片3次。洗片后，滴加一抗HSP70（1∶500），置于4℃孵育过夜，孵育后使用PBS洗片3次，滴加荧光二抗（1∶200），室温避光孵育1 h，孵育后使用PBS洗片3次，向切片滴加DAPI核染，于室温避光孵育10 min。使用PBS洗片，向切片滴加抗荧光淬灭封片剂后封片，荧光倒置显微镜下观察切片，镜下扫描获得图像。

1.6.3 Western blot检测海马中HSF1、HSP70蛋白含量表达水平

各组小鼠随机选取2只，麻醉方法同前，达到深度麻醉标准后，无菌环境下冰上操作，迅速断头取脑，剥离出新鲜海马组织，RIPA法制备海马组织总蛋白，并用BCA蛋白试剂盒检测样本蛋白浓度，配置10%SDS-PAGE凝胶，每孔依次上样40 μg后依次电泳和转膜；将PVDF膜置TBST室温封闭1 h，洗膜后将膜置于HSF1（1∶1000），HSP70（1∶1000）抗体稀释液中，并置4℃冰箱孵育过夜；洗膜后将PVDF膜置稀释后的二抗（1∶10000），室温孵育1 h；向膜上滴加适量ECL显色液，置凝胶成像仪曝光各组条带值；应用Image J计算各条带灰度值。

1.6.4 免疫荧光检测小鼠皮层和海马中HSP70和Aβ1-42、T-Tau共定位关系

对1.6.2中石蜡包埋的脑组织进行两组切片，脱蜡并进行抗原修复，置5% BSA封闭2h；PBS洗片，其中一组向切片滴加稀释一抗HSP70（1∶500）和Aβ1-42（1∶200），另外一组向切片滴加稀释一抗HSP70（1:500）和T-Tau（1∶500），置4℃冰箱孵育过夜；PBS洗片，两组分别向切片滴加稀释荧光二抗（1∶200），室温避光孵育1 h；PBS洗片，向切片滴加DAPI染色液，室温避光染色10 min。PBS洗片，滴加抗荧光淬灭封片剂，中性树胶封片。荧光倒置显微镜下观察切片并拍照。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对实验数据处理，实验结果以均值 ± 标准差（）表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多组间比较采用LSD法，P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学改变

与Control组比较，各组小鼠平均游泳速度差异无统计学意义（P＞ 0.05），Model组小鼠游泳总路程和平台潜伏期明显延长，其差异具有高度统计学意义（P＜0.01），穿越平台次数明显减少，其差异具有高度统计学意义（P＜ 0.01）；与Model组比较，GGA组和HLJD组小鼠游泳总路程和平台潜伏期明显缩短，其差异具有统计学意义（P＜ 0.05），穿越平台次数均有不同程度的增加，其差异均具有统计学意义（P＜ 0.05）。各组小鼠Morris水迷宫检测结果见表1，各组小鼠Morris水迷宫试验代表性轨迹图见图1.

2.2 各组小鼠皮层和海马区HSP70表达变化

与Control组相比较，Model组小鼠皮层和海马区HSP70表达量增高；与Model组相比较，GGA组和HLJD组小鼠皮层和海马各个区域的绿色荧光表达均有不同程度的增强，以CA3区和DG区更为明显，见图2。

2.3 各组小鼠海马中HSF1、HSP70蛋白表达变化

与Control组相比较，Model组小鼠海马组织中的HSF1、HSP70均明显上升，其差异具有统计学意义或高度统计学意义（P＜ 0.05）；与Model组相比较，GGA组小鼠海马组织中HSF1有明显的上调，其差异具有高度统计学意义（P＜ 0.01），HLJD组与Model组的差异无统计学意义（P＞ 0.05），GGA组和HLJD组HSP70蛋白的差异均具有高度统计学意义（P＜ 0.01）。各组小鼠海马组织中HSF1、HSP70蛋白表达变化见图3.

2.4 HLJD组小鼠脑组织中HSP70和Aβ1-42、T-Tau共定位实验结果

镜下观察提示，无论是海马区还是在皮层，单独的红色荧光数量多于单独的绿色荧光数量，这说明给予HLJD之后的小鼠脑内HSP70蛋白表达增多，而Aβ1-42蛋白表达减少。镜下可见由红色荧光的HSP70和绿色荧光的Aβ1-42重叠的黄色荧光，在胞内胞外均可见，部分未重叠的HSP70均匀分布在Aβ1-42周围，这说明两者确实具有相同的表达位置，HSP70蛋白可能在胞内胞外都对Aβ1-42蛋白的生成和进一步聚集都发挥了干预作用。HLJD组小鼠皮层和海马区HSP70和Aβ1-42共定位检测结果见图4。

同时，本实验还观察到了小鼠脑组织中单独的HSP70红色荧光数量多于单独的Tau绿色荧光数量，这说明给予黄连解毒汤之后的小鼠脑内HSP70蛋白表达增多，而Tau蛋白表达减少。镜下可见由红色荧光的HSP70和绿色荧光的Tau重叠的黄色荧光，几乎都分布在胞外，这说明HSP70可能是在胞外发挥了对Tau磷酸化的抑制作用。HLJD组小鼠皮层和海马区HSP70和Tau共定位检测结果见图5。

表1 各组小鼠Morris水迷宫检测结果（，n = 12）

表1 各组小鼠Morris水迷宫检测结果（，n = 12）

注：与Control组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；与Model组比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

穿越平台次数（n）4.833 ± 2.17 1.417 ± 0.901**3.417 ± 1.677△3.163 ± 2.41△组别Control Model HLJD GGA平均游泳速度（cm/s）7.393 ± 1.155 7.167 ± 1.030 6.897 ± 0.853 6.767 ± 1.115游泳总路程（cm）193.455 ± 35.441 508.917 ± 46.038**468.700 ± 22.166△440.182 ± 83.630△上平台潜伏期（s）24.455 ± 3.446 67.417 ± 5.299**61.603 ± 3.718△61.818 ± 3.710△

图1 各组小鼠Morris水迷宫试验轨迹图

图2 各组小鼠皮层和海马区HSP70蛋白表达（免疫荧光，× 400）

图3 各组小鼠海马组织中HSF1、HSP70蛋白表达变化（n = 2）

图4 HLJD组小鼠皮层和海马区HSP70和Aβ1-42共定位（免疫荧光，× 400）

图5 HLJD组小鼠皮层和海马区HSP70和Tau共定位（免疫荧光，×400）

3 讨论

中医学对AD的认识，尤其是其症状和病机的认识由来已久，根据AD的临床表现，可以在中医古籍“呆病”“痴呆”“健忘”“善言误”“不慧”“白痴”“不眠”“童昏”“神呆”中找到一些对应的记载，这些记述有些比较贴合现代医学对AD的认识，也有一些不完全符合[13]，各种记述对AD的病机及其发展变化的描述也不尽相同。中医学对AD的治疗上多从“虚”“痰”“瘀”论治，以补虚、补肾、化痰、化瘀等痰瘀同治法为主，近年来清热解毒法防治AD也越来越受到重视，以黄连解毒汤为代表的清热解毒法治疗AD安全有效，可改善AD患者认知功能和日常生活能力[8,14]。我们系统梳理了近70年来的文献报道，并对文献中AD相关的证素信息进行了统计分析，发现从1960年开始，对AD的认识逐渐从“虚”“痰”“瘀”“肾”“脑”等证素的单一或复合描述逐渐丰富为“虚”“痰 ”“瘀 ”“热 ”“毒 ”“肾 ”“脾 ”“ 心 ”“ 脑 ”“ 肝 ”等 证 素 的单一或复合描述，从以虚证多见到痰瘀为主，且对AD中的“热”和“毒”的认识越来越丰富和细致，这可能与时代的变迁，人们的生活水平发生改变，人均寿命延长、医疗条件改善、饮食和环境变化等多因素影响有关。

在AD患者绵长的病理进程中，痰、瘀与热互相搏结，酿为浊毒，损伤脑络，而致脑消髓减发为痴呆。热结酿毒是AD发展至不可逆转的终末环节的关键病机，有研究通过中医药知识图谱分析认为痴呆病机为痰浊蒙窍、瘀阻脑络、痰热、瘀热[15]。本团队也从热（火）论治痴呆的病因病机理论和作用机制作了深入探讨[16-18]。近年来许多研究者发现部分抗炎药和清热解毒中药对老年性痴呆产生有利的影响，并由此提出脑神经细胞淀粉样变性和内毒蕴积、热伤脑络的科学假说[19]。黄连解毒汤为泻火解毒的良方，在现代研究中也发现该方能下调β-APP基因表达，增强清除过氧化物和抗氧化能力，增加海马组织中SOD和GSH的活性，减少MDA的生成，影响I-κB和NF-κB蛋白表达，改善大鼠海马神经元细胞的病理形态、体内炎症和氧化应激状态，调节脂质代谢和肠道微环境，还可以通过调控星形胶质细胞和小胶质细胞发挥抗神经炎症的作用，从而改善AD小鼠的学习认知能力[20-22]。此外，也有研究证实了黄连解毒汤可以在血管性疾病中发挥抗炎和抗氧化的作用[23]，还可以改善糖尿病和心脑血管疾病相关的代谢物小分子[24]。

HSP70是HSP中结构和功能最保守的蛋白质。HSP70是最普遍存在的一类ATP依赖性伴侣蛋白，可在许多不同条件下发挥细胞保护作用，在细胞蛋白质量控制和降解系统中起着核心作用[25]。在人体中，HSP70多基因家族对由ATP结合和水解推动的非天然多肽发挥着作用[26]。HSP70与蛋白质底物结合，以帮助其折叠、降解、运输、调节和防止聚集[27-28]。有研究表明HSP可以改善AD脑内氧化应激状态、调控线粒体功能、促进与泛素的结合和降解、在突触膜上阻止错误折叠蛋白的聚集、选择性降解溶酶体中含有共有肽基序的可溶性蛋白，进而使AD病理状态的减轻甚至恢复[29]。

在本实验中，首先用免疫荧光标记的方法证实了在APP/PS1双转基因的模型组小鼠脑组织中，由于Aβ淀粉样蛋白异常增加，导致了寡聚态的Aβ增多，为了探索清热解毒法是否是通过调控HSP70发挥的作用，本实验对各组小鼠脑组织中的HSP70进行了标记，镜下可见C57正常小鼠的空白对照组无论是皮层还是海马区均有少量绿色荧光表达，Hoshino等[4,30]报道了转基因AD小鼠的大脑中HSP70表达水平的升高，这与我们观察到的结果一致。各给药组小鼠皮层和海马各个区域的HSP70绿色荧光表达均有不同程度的增强，以CA3区和DG区更为明显，这说明清热解毒可能通过上调HSP70蛋白发挥神经保护作用。进一步对各组小鼠海马组织中的HSF1、HSP70进行了Western blot分析，结果发现与普通C57小鼠相比，模型组小鼠海马组织中的HSF1、HSP70均明显上升。与模型组相比，普瑞酮组小鼠海马组织中HSF1有明显的上调，而黄连解毒汤组与模型组则没有明显差异，其余各给药组与模型组相比，HSP70蛋白的差异均具有高度统计学意义。HSF1是HSP70激活的上游调控蛋白，普瑞酮组可以直接激活HSF1的表达，从而促进HSP70蛋白的表达，故而普瑞酮组组HSF1蛋白的表达明显高于其它各组，进一步提示黄连解毒汤可能是通过调控HSP70来发挥改善小鼠学习和认知功能的作用。

为进一步探索HSP70是不是通过直接抑制Aβ和Tau蛋白聚集发挥改善小鼠学习和认知功能作用，结合既往研究者的研究基础，通过免疫荧光标记技术观察了HSP70蛋白和Aβ、Tau蛋白之间的共定位关系，初步推定它们之间可能的作用关系。在镜下观察到，无论是海马区还是在皮层，单独的HSP70荧光数量多于单独的Aβ荧光数量，这说明给予黄连解毒汤后的小鼠脑内HSP70蛋白表达增多，而Aβ蛋白表达减少。胞内外均可见由红色荧光的HSP70和绿色荧光的Aβ重叠的黄色荧光，部分未重叠的HSP70均匀分布在Aβ周围，这说明两者确实具有相同的定位关系，HSP70蛋白可能在胞内外都对Aβ蛋白的生成和进一步聚集都发挥了干预作用。同时还在镜下观察到了小鼠脑组织中单独的HSP70红色荧光数量多于单独的Tau绿色荧光数量，这说明给予黄连解毒汤之后的小鼠脑内HSP70蛋白表达增多，而Tau蛋白表达减少。镜下可见由红色荧光的HSP70和绿色荧光的Tau重叠的黄色荧光几乎都分布在胞外，这说明HSP70可能是在胞外发挥了对Tau磷酸化的抑制作用。

综合上述分析，黄连解毒汤可改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力，其机制可能与其上调HSP70蛋白抑制Aβ沉积以及Tau磷酸化有关。