红景天苷及其联合羟基喜树碱或紫杉醇对乳腺癌细胞增殖的抑制作用研究＊

孙安琪，胡志烨，巨修练

（1.武汉工程大学邮电与信息工程学院 武汉 430072；2.武汉大学药学院 武汉 430071；3.武汉工程大学化工与制药学院 武汉 430072）

乳腺癌是女性最为多发的恶性肿瘤之一。目前临床上各种化疗药物的应用使肿瘤的治疗效果有所改善。但是这些化疗药物仍然存在毒副作用大的问题，并且使用一段时间后，肿瘤细胞也可能产生耐药性。所以，在临床上考虑联合用药是改善现状的一个途径。

由于联合用药针对不同的靶点，在降低单药使用剂量的同时，还能产生协同作用，提高疗效、降低不良反应、避免肿瘤细胞产生耐药性，因此逐渐成为癌症治疗的首选方案[1]。将药物联合使用之后，最终可能产生协同作用，也可能作用相加或者拮抗。所以，需要采取科学、有效的方法来判定药物之间相互作用的结果。目前，联合指数法较为常用，它是Chou和Talalay以质量守恒定律为基础，提出的联合指数判定法，也称为CI法。本文也是采取的CI法来判断药物之间的协同效应[2]。

喜树碱类药物主要作用于细胞S期，影响DNA功能，导致细胞凋亡。但是在临床上使用会产生较大的不良反应，通过不断的结构改造，目前常用的药物有伊立替康、拓扑替康等，并且它们也常与吉西他滨、5-氟尿嘧啶、阿霉素以及顺铂等联合应用，取得了一定的治疗效果[3-6]。同时，考虑将羟基喜树碱与安全低毒的中药有效成分联合使用，考察联合用药的效果。

紫杉醇可以维持微管蛋白稳定、抑制细胞有丝分裂，还能控制肿瘤细胞进一步的扩散。在临床上，化疗完成后，常用紫杉醇进一步进行配合治疗，可以提高患者的顺应性[7-8]。但是紫杉醇作为细胞毒性药物，在使用过程中也可能影响正常细胞，导致不良反应的发生。

红景天苷是红景天根茎中分离出来的主要活性成分，对乳腺癌治疗具有一定作用。但是，目前能够应用到临床治疗肿瘤的红景天苷未见报道，并且关于它联合用药的研究也不多见。由于红景天苷毒副作用较小，是非常具有吸引力的化药佐药候选者[9]。因此本文探讨单独应用红景天苷及其联合羟基喜树碱或紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用，利用联合指数法判断联合用药的效果，为后续研究提供相应的数据参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株

乳腺癌细胞MCF-7株购自ATCC（American type culture collection，美国模式培养物集存库）。

1.2 主要试剂与仪器

红景天苷（99.9%，武汉信嘉和诚药物化学有限公司）；羟基喜树碱（上海秦巴化工有限公司）；紫杉醇（99.5%，武汉贝尔凯生物科技有限公司）；DMEM培养基（HyClone公司）；胎牛血清（AusGeneX）；MTT（BioSharp公司）；酶标仪（biotec elx800）；细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；96孔板（耐思生物科技有限公司）。

1.3 细胞培养

乳腺癌细胞MCF-7待密度长至80%-90%时，消化并吹散细胞后，使用含10% FBS（fatal bovine serun，胎牛血清）的无酚红DMEM培养基铺96孔板，每孔约8000-10000个细胞，前后左右推动96孔板使细胞均匀分散，转移至细胞培养箱中。

1.4 药物分组

待细胞完全贴壁后，先使用含10% FBS的无酚红DMEM培养基将红景天苷组配制成以下浓度梯度：1000.00、800.00、600.00、500.00、400.00、300.00、200.00、100.00、50.00 μmol·L-1；羟基喜树碱组配制成以下浓度梯度：250.00、100.00、50.00、25.00、12.50、5.00、2.50、0.50、0.25 μmol·L-1；紫杉醇组配制成以下浓度梯度：0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、6.00、8.00、10.00 μmol·L-1；然后吸出 96孔版中原培养基，分别加入上述化合物溶液以及两者混合物，每个浓度梯度设置6个重复孔。

1.5 MTT法检测细胞增殖

将细胞与药液共孵育3天，取出96孔板，每孔在生物安全柜中避光加20 μL MTT溶液，轻轻摇晃混匀后，放回细胞培养箱中孵育4 h。取出96孔板，小心吸出液体（尽量避免吸出结晶物），然后每孔加入100 μL DMSO，放在微量振荡器上震荡15 min充分溶解结晶。放入酶标仪，选取490 nm波长扫读96孔板，并保存数据。

1.6 结果判定

采用CHOU-TALALAY联合指数法。已知：中效方程fa/fu=(D/Dm)m，其中fa为效应，也就是抑制率，fu=l-fa，D为药物浓度，Dm为中效浓度，m为斜率。根据实验所得fa和D值，计算单独使用药物时的Dm，以及药物联用时的Dm。由中效方程的公式，可推导出 D=Dm (fa/fu)1/m。再计算联合指数CI=(D)l/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+α(D)1(D)2/ (Dx)1(Dx)2，其中(D)1、(D)2为合用产生 X 效应时，两药的浓度，(Dx)1、(Dx)2为单用产生X效应时，两药的浓度，α=0为排斥性药物，α=1为非排斥性药物。若CI＜1两药为协同作用，数值越小，产生的协同作用越强；若CI=1为相加作用；若CI＞1为拮抗作用，数值越大，产生的拮抗作用越强。

1.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 红景天苷对乳腺癌细胞MCF-7的生长具有明显的抑制作用。

统计学分析结果表明，红景天苷各浓度组的OD值与空白对照组差异均达显著水平（P＜0.05），并且细胞生长抑制率随红景天苷浓度的升高而增高，说明红景天苷对乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制作用存在剂量依赖性（表1，图1）。同样，分别使用羟基喜树碱和紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7的生长也具有抑制作用，并呈浓度依赖性（表2，表3；图2，图3）。

2.2 联合应用红景天苷及羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响。

红景天苷和羟基喜树碱联用对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制率（表4，图4）均高于单独使用各药物时的抑制率（表5，图5）。并且红景天苷与羟基喜树碱的浓 度 为（200.00+2.50）、（300.00+5.00）、（400.00+12.50）、（500.00+25.00）、（600.00+50.00）、（800.00+100.00）、（1000.00+250.00）μmol·L-1时，CI值小于1，说明在此浓度下，两者联用可以产生协同作用。

表1 红景天苷对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响（n=6）

图1 红景天苷对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响

表2 羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响（n=6）

2.3 联合应用红景天苷及紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响。

红景天苷和紫杉醇联用对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制率（表6，图6）均高于单独使用各药物时的抑制率（表7，图7）。并且红景天苷与紫杉醇的浓度为（100.00+0.05） 、（200.00+0.10） 、（300.00+0.50） 、（400.00+1.00） 、（500.00+2.00） 、（600.00+6.00） 、（800.00+8.00）、（1000.00+10.00）μmol·L-1时，CI值小于1，说明在此浓度下，两者联用可以产生协同作用。

表3 紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响（n=6）

图2 羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响

图3 紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响

表4 联合应用红景天苷及羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响（n=6）

图4 联合使用红景天苷与羟基喜树碱对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响

3 讨论

红景天作为一种富含多糖类物质和免疫活性物质的传统中药，已被广泛用于预防高原病、抗衰老、抗抑郁以及消除疲劳等方面。已证实红景天的有效成分红景天苷可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，从而发挥抗肿瘤作用[10-11]。

图5 单独使用红景天苷、羟基喜树碱以及联合使用两药对细胞增殖的抑制率的影响

MTT法检测结果显示，红景天苷对乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有抑制作用，并且当红景天苷浓度增加，其对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率也相应升高。细胞形态在细胞周期中发生一系列变化，其中G1至S期以及G2至M期是两个重要的阶段。在此期间，发生了活跃且复杂的分子水平的相关变化，并且易受外界的影响，这也是学者们十分关注的阶段。一般情况下，p27（Kip1）和p21（Cip1）上调，周期蛋白依赖激酶4（Cyclin-dependent kinase, CDK4）和特异性周期蛋白-D1（Cyclin D1）下调，细胞正常生长[12]。当受到调控或者一些外界不利因素介入，则会导致细胞生长阻滞在此阶段，从而抑制了细胞的生长。推测乳腺癌细胞的生长依赖于细胞周期的正常进行，一旦通过调控相关基因的表达，阻滞了细胞周期，则可抑制乳腺癌细胞的增殖。

肿瘤的生长取决于细胞增殖与细胞凋亡的比例，其中细胞凋亡的过程受到凋亡基因的调控，有研究也指出乳腺癌的发生发展与凋亡失调有关[13]。也就是说，相关凋亡基因在被激活、表达或者调节过程中，出现了异常。较为常见的凋亡基因有凋亡抑制基因p53和B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），以及促凋亡基因Bax（Bcl-2相关X蛋白，Bcl-2-Associated X）等。红景天苷可能通过调节以上基因的表达，诱导乳腺癌细胞凋亡，从而抑制其生长。

表6 联合应用红景天苷及紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响（n=6）

图6 联合使用红景天苷与紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7抑制率的影响

图7 各浓度红景天苷、紫杉醇及联合应用对乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制率的影响

同时还推测红景天苷的乳腺癌细胞抑制作用还与诱导乳腺癌细胞分化有关。诱导细胞分化的过程，没有对细胞造成损伤，而是通过调控，使细胞的发展趋于正常化[14]。其中，c-myc基因可促进细胞分裂，启动细胞分化，在乳腺癌细胞的增殖过程中起到了较大的作用。当上调c-myc基因水平，细胞增殖；相反的，若下调c-myc基因水平，则抑制了细胞的增殖。推测红景天苷也可能抑制了c-myc的表达，使乳腺癌细胞增殖作用受到控制，继而起到抗乳腺癌的效应。

自噬是在外界条件发生变化时，细胞可能会吞噬自己的细胞器或者细胞质蛋白，然后进入囊泡，与溶酶体结合，生成自噬溶酶体，再在蛋白水解酶的作用下降解，从而实现细胞的代谢和更新[15]。自噬在病理状态下也很常见，尤其在肿瘤的发展进程中有不可忽视的作用。这其中有许多相关基因参与了调控，比如LC3是自噬标志物，主要参与自噬小体的形成[16]。LC3前体分子首先裂解形成胞质形式的LC3-I，被激活后，形成膜结合形式的LC3-II，附着在溶酶体膜上，最后被降解[17]。推测红景天苷可以通过促进LC3的表达，从而诱导细胞自噬，抑制乳腺癌的发展。

红景天苷也能通过调控多途径的信号通路，起到抗乳腺癌的作用[18-19]。推测红景天苷抑制了基质金属蛋白酶（Matrix metallopeptidase，MMP）-2、MMP-9、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）以及血管内皮生长因子受体-2（Vascular epidemal growth factor receptor-2，VEGFR-2）等蛋白的表达，调节PI3K/Akt/mTOR、EGFR/JAK2/STAT3信号通路，诱导细胞凋亡，或者抑制细胞迁移和血管生成。

表7 单独使用红景天苷、紫杉醇以及联合用药细胞增殖抑制率（%）

目前临床上多数化疗药物具有较大的副作用，并且肿瘤细胞也易产生多药耐药性。基于红景天苷具有一定的抑制乳腺癌细胞增殖的作用，故考虑将其与阳性药物联合使用，并评价其效果。实验结果显示，联合应用高、中剂量的红景天苷与羟基喜树碱或紫杉醇在抗乳腺癌细胞MCF-7增殖方面存在协同作用。关于联合给药，协同抗肿瘤的机制也可能与影响凋亡信号通路、逆转肿瘤多药耐药性、抑制细胞增殖和侵袭等方面有关。

羟基喜树碱可以通过抑制DNA拓扑异构酶I，对DNA的合成起到抑制作用，最终导致DNA单链或者双链的断裂，继而诱导细胞的凋亡[20]。但该药易产生骨髓抑制等不良反应，所以考虑联合用药，提高疗效的同时，减少不良反应，还可降低细胞耐药性的产生[21]。而红景天苷能够抑制拓扑异构酶的活性[22]，与典型的拓扑异构酶I抑制剂羟基喜树碱联合使用，具有良好的协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。

细胞凋亡是细胞自动死亡的重要形式，凋亡刺激信号可以激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinas，caspase）相关途径。推测红景天苷与紫杉醇联用之后，红景天苷能够增强紫杉醇的激活作用。该激活作用通过线粒体细胞C释放到细胞质，与凋亡蛋白酶激活因子1结合形成多聚体，再与caspase-9结合形成凋亡小体，并且激活下游凋亡分子caspase-3，从而诱发细胞凋亡[23]。p53是Bax的转录激活剂，也是Bcl-2的转录抑制剂，通过调控Bax/Bcl-2的比例，可以诱导激活caspase-9，进一步作用于caspase-3，促进细胞凋亡[24]。在阻滞肿瘤细胞周期方面，紫杉醇是将细胞阻滞在了S期[25]，红景天苷可能通过下调Cdc2及Cyclin B1的表达，将细胞阻滞在G2期，进而抑制肿瘤细胞的增殖[26]。由于该时期是DNA合成前的关键时期，因此减少DNA的合成，协同抑制细胞增殖的不同阶段，诱导细胞进入程序性死亡。我们推测，红景天苷与紫杉醇作用于细胞周期的不同时期可能是两种药物联用促进细胞凋亡的机制，另外红景天苷抑制相关信号通路的激活，也能降低紫杉醇药物抗性的作用，其具体的抗癌机制以及体内的效应有待进一步研究。

临床上，传统经典的抗肿瘤药物会随着治疗时间的延长而疗效减弱。此时，若单纯地增加给药剂量，会增加药物的毒副作用，导致患者的顺应性降低。目前，抗肿瘤的研究趋向于采用联合用药的设计思路，通过不同靶点的作用，起到辅助和协同的作用，减少不良反应的同时，达到更好的治疗效果[27-28]。因此，在抗肿瘤治疗时，将红景天苷与羟基喜树碱或紫杉醇合理配伍联合使用，也为临床治疗提供了新思路和实验依据。

然而，红景天苷与抗乳腺癌药物协同作用的机制有待进一步明确，也可以将体外的协同作用实验延伸至体内实验，从而由单一成分向联合应用进行纵深研究。